(一) 肺炎支原体的简述
肺炎支原体（Mycoplasma pneumonia，Mp）是一种常见的病原微生物，主要引起人类呼吸道感染，尤其以儿童和青年为主。Mp是儿童社区获得性肺炎（community-acquired pneumonia，CAP）的重要病原体），可占CAP的10%-30%。
据WHO公布的数据显示，全球每年约有1.56亿例儿童临床性肺炎新发作，其中95％以上发生在发展中国家。在2015年世界上就有920136名5岁以下儿童死于肺炎。其中由肺炎支原体引起的感染数量排第二，仅次于肺炎链球菌。针对Mp感染及其肺炎等引起误诊、漏诊及过度诊断在临床上亟待解决。
(二) 儿童Mp感染误诊、漏诊及过度诊断的原因
1. 临床表现不典型、缺乏特异性，不同年龄阶段的临床表现各不相同，尤其在婴幼儿。
2. 以肺外表现为首发者往往被漏诊，混合感染患儿Mp作为病原也易被忽视。
3. 部分MPP患儿呼吸系统症状轻，甚至无呼吸道症状，影像学异常改变滞后，从而未做MP病原学检查而导致漏诊。尚需注意有些确诊为MPP的患儿胸部CT发现的异常在胸X线片上未能显示出来。
4. 大环内酯类抗菌药物耐药的Mp感染者，经验性给予大环内酯类疗效不佳，届时如果轻易除外Mp感染就有可能导致漏诊。
5. 实验室诊断误差致临床误诊、漏诊和过诊：
1) 血清学检测IgM抗体误差，Mp抗体检测应该定量而非定性，单纯定性容易过多诊断Mp感染。此外，一项调查急性Q热肺炎流行率的研究表明，Q热肺炎者可由于交叉反应引起Mp－IgM阳性，容易被误诊为MPP。
2) PCR检测误差，虽然核酸扩增技术有特异性强、灵敏和快速的优点，但也不可忽略样品中存在PCR抑制物、试剂制备和反应条件不理想、靶DNA提取效率低下等造成假阴性的情况。感染Mp后可不出现症状但持续携带，这会造成假阳性的结果。核酸扩增DNA检测并不能区分携带者与感染者、急性感染者与恢复期患者，单纯依赖PCR检测有可能导致MP感染的过度诊断。
(三) 国际上Mp感染诊断策略
国内Mp的诊断策略
随着Mp感染重症和难治病例的不断增多，早期、快速、准确诊断是临床对实验室诊断方法学提出的迫切需求，而实验室结果的合理解读也是临床恰当诊治的重要前提；目前，Mp的检测方法主要分为病原学检测和血清学检测两大类，根据《中国儿童肺炎支原体感染实验室诊断规范和临床实践专家共识（2019年）》提出建议，Mp感染的实验室诊断，抗体检测优先于抗原检测，如能获取急性期与恢复期双份血清，抗体检测的价值更大。
《儿童肺炎支原体呼吸道感染实验室诊断中国专家共识》的感染实验室诊断流程图如下：
在台湾长庚医院的儿童肺炎支原体肺炎的合理分阶段治疗流程图中，其Mp感染的实验室诊断策略为：
1) 血清转化（IgM由阴性转化为阳性）；
2) 间隔两周内，抗体滴度增加（IgM增加2倍或IgG增加4倍）；
3) PCR 阳性。
国外Mp的诊断策略
在瑞士苏黎世儿童医院的研究中，在的检测过程中，Mp-IgM和PCR联检可使其阳性检测率高达99%。
终上所述，国际上Mp感染的血清学以血清学联合病原学检测为诊断策略。
(四) Mp抗体免疫应答的抗原选择策略
Mp的血清抗体
人体感染Mp后能产生IgM、IgA、IgG类抗体：
IgM：感染一周内升高，2-3周达到高峰，4周后开始下降，2-3月降至最低，可作为近期感染的诊断指标；
IgA：感染早期迅速上升，7-14天至峰值水平，变化与IgM一致，但回落更早；
IgG：感染后14天左右出现，在第5周达到高峰，可长期维持，提示既往感染。
Mp的血清抗体的免疫应答反应
在法国的圣艾蒂安大学的微生物实验室的研究中，Mp可引起多种免疫应答，通过试验来确定在MP患者的血清中产生免疫应答的主要蛋白，从结果中可以看出，患者血清中可识别的MP蛋白可多达30多种，其中主要以180kDa、172KDa、120kDa、115kDa、92kDa、84kDa、66kDa、55kDa、43kDa等。
1) Mp-IgM产生的免疫应答
Mp患者的血清中，在感染过程中的第二周直至第三周，IgM所识别的蛋白主要有168kDa、155kDa、145kDa、84kDa、56kDa等多个蛋白位点，直到第4-5周其所引起的条带略微下调。
2) Mp-IgG产生的免疫应答
Mp患者的血清中，在感染过程所识别的蛋白变化很大，但从感染至整个过程中持续引起IgG免疫应答的主要蛋白为168kDa。
Mp的血清抗体的抗原策略
用于抗体检测试剂的Mp抗原选择非常重要，他决定了检测的敏感度和特异度，根据上述所列的抗体及抗体参与的免疫应答情况可知，目前主要的抗原为全菌体抗原和P1黏附蛋白。
1) 关于全菌体抗原
Mp全菌体裂解物（全菌体抗原）：
包括细胞膜的糖脂、蛋白质等成分；涵盖抗原位点齐全，可用于Mp-IgM、Mp-IgG抗体检测。
2) 关于Mp-P1蛋白
Mp-P1蛋白能刺激机体产生较强烈的免疫应答，是Mp诊断的重要抗原；其中P1基因包含4881个核苷酸，可编码1627个氨基酸，其中包含了21个UGA密码子，在编码的过程中，UGA是终止密码子。因此重组蛋白无法获取P1蛋白的全长片段，通常以N端（P1-N1）和C端（P1-C1）区域为黏附蛋白的免疫区。
N端（P1-N1）分子量：13.9kDa；
C端（P1-C1）分子量：~39.7kDa；
在免疫印迹过程中发现，两者均能与单抗反应，患者血清只识别重组纯化C端（P1-C1）。
在重组表达的过程中，不同的提取方法获取的蛋白浓度不同；如下图：
１：大肠杆菌的空载体
２：大肠杆菌诱导表达重组P1的裂解物；
３：超声和离心后细胞裂解物的沉淀部分；
４：超声和离心后细胞裂解物的上清液；
５：色谱提纯；
６：凝胶过滤和色谱法提纯。
由此可知，其蛋白的纯度与提纯方式有关，色谱法可获取较高纯度的P1重组蛋白。
在同等的浓度168kDa的蛋白含量的反应过程中发现，Mp-IgG与P1蛋白的吸光值高于Mp-IgM，由此可知，P1蛋白与Mp-IgG的免疫应答反应性更高，更适用于于Mp-IgG检测。
在荷兰莱顿大学医学中心的研究中，比较了12种检测Mp-IgM和Mp-IgG抗体的检测试剂，结果表明，使用全菌体抗原的SerodiaMycoII、ImmunoWell和CFT的诊断性能比较高，使用富含P 1抗原的诊断Mp-IgM的性能不如含全菌体抗原，其中使用SERION全菌体抗原的CFT试剂检测Mp-IgM的准确度最高，其中ROC曲线也为最高。
(五) 总结
综上所述，Mp是CAP的常见病原体，早期、快速、准确诊断是解决Mp感染的临床学若干问题的关键，合理的应用诊断策略和选择合适的抗原策略是提高Mp感染实验室诊断的必要条件，也是结合临床恰当诊治的重要前提。
作者：维润赛润 原料事业部
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编辑：Steven | 校对：Harris | 责编：Hillson
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