肺炎支原体丨可为和有为,呼吸道症候群病原体检测系列抗原详解Ⅲ

添加时间:2021年7月21日

肺炎支原体丨可为和有为,呼吸道症候群病原体检测系列抗原详解Ⅲ

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肺炎支原体丨可为和有为,呼吸道症候群病原体检测系列抗原详解Ⅲ

(一) 肺炎支原体的简述

肺炎支原体(Mycoplasma pneumonia,Mp)是一种常见的病原微生物,主要引起人类呼吸道感染,尤其以儿童和青年为主。Mp是儿童社区获得性肺炎(community-acquired pneumonia,CAP)的重要病原体),可占CAP的10%-30%。

据WHO公布的数据显示,全球每年约有1.56亿例儿童临床性肺炎新发作,其中95%以上发生在发展中国家。在2015年世界上就有920136名5岁以下儿童死于肺炎。其中由肺炎支原体引起的感染数量排第二,仅次于肺炎链球菌。针对Mp感染及其肺炎等引起误诊、漏诊及过度诊断在临床上亟待解决。

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(二) 儿童Mp感染误诊、漏诊及过度诊断的原因

1. 临床表现不典型、缺乏特异性,不同年龄阶段的临床表现各不相同,尤其在婴幼儿。

2. 以肺外表现为首发者往往被漏诊,混合感染患儿Mp作为病原也易被忽视。

3. 部分MPP患儿呼吸系统症状轻,甚至无呼吸道症状,影像学异常改变滞后,从而未做MP病原学检查而导致漏诊。尚需注意有些确诊为MPP的患儿胸部CT发现的异常在胸X线片上未能显示出来。

4. 大环内酯类抗菌药物耐药的Mp感染者,经验性给予大环内酯类疗效不佳,届时如果轻易除外Mp感染就有可能导致漏诊。

5. 实验室诊断误差致临床误诊、漏诊和过诊:

1) 血清学检测IgM抗体误差,Mp抗体检测应该定量而非定性,单纯定性容易过多诊断Mp感染。此外,一项调查急性Q热肺炎流行率的研究表明,Q热肺炎者可由于交叉反应引起Mp-IgM阳性,容易被误诊为MPP。

2) PCR检测误差,虽然核酸扩增技术有特异性强、灵敏和快速的优点,但也不可忽略样品中存在PCR抑制物、试剂制备和反应条件不理想、靶DNA提取效率低下等造成假阴性的情况。感染Mp后可不出现症状但持续携带,这会造成假阳性的结果。核酸扩增DNA检测并不能区分携带者与感染者、急性感染者与恢复期患者,单纯依赖PCR检测有可能导致MP感染的过度诊断。

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(三) 国际上Mp感染诊断策略

1.

 国内Mp的诊断策略

随着Mp感染重症和难治病例的不断增多,早期、快速、准确诊断是临床对实验室诊断方法学提出的迫切需求,而实验室结果的合理解读也是临床恰当诊治的重要前提;目前,Mp的检测方法主要分为病原学检测和血清学检测两大类,根据《中国儿童肺炎支原体感染实验室诊断规范和临床实践专家共识(2019年)》提出建议,Mp感染的实验室诊断,抗体检测优先于抗原检测,如能获取急性期与恢复期双份血清,抗体检测的价值更大。

《儿童肺炎支原体呼吸道感染实验室诊断中国专家共识》的感染实验室诊断流程图如下:

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图1  Mp呼吸道感染实验室诊断流程图

在台湾长庚医院的儿童肺炎支原体肺炎的合理分阶段治疗流程图中,其Mp感染的实验室诊断策略为:

1) 血清转化(IgM由阴性转化为阳性);

2) 间隔两周内,抗体滴度增加(IgM增加2倍或IgG增加4倍);

3) PCR 阳性。

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图2:儿童肺炎支原体肺炎的合理分阶段治疗

2.

国外Mp的诊断策略

在瑞士苏黎世儿童医院的研究中,在的检测过程中,Mp-IgM和PCR联检可使其阳性检测率高达99%。

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图3:儿童肺炎支原体肺炎的联合检测

终上所述,国际上Mp感染的血清学以血清学联合病原学检测为诊断策略。

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(四) Mp抗体免疫应答的抗原选择策略

1.

Mp的血清抗体

人体感染Mp后能产生IgM、IgA、IgG类抗体:

IgM:感染一周内升高,2-3周达到高峰,4周后开始下降,2-3月降至最低,可作为近期感染的诊断指标;

IgA:感染早期迅速上升,7-14天至峰值水平,变化与IgM一致,但回落更早;

IgG:感染后14天左右出现,在第5周达到高峰,可长期维持,提示既往感染。

2.

Mp的血清抗体的免疫应答反应

在法国的圣艾蒂安大学的微生物实验室的研究中,Mp可引起多种免疫应答,通过试验来确定在MP患者的血清中产生免疫应答的主要蛋白,从结果中可以看出,患者血清中可识别的MP蛋白可多达30多种,其中主要以180kDa、172KDa、120kDa、115kDa、92kDa、84kDa、66kDa、55kDa、43kDa等。

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图4:肺炎支原体的免疫应答反应

1) Mp-IgM产生的免疫应答

Mp患者的血清中,在感染过程中的第二周直至第三周,IgM所识别的蛋白主要有168kDa、155kDa、145kDa、84kDa、56kDa等多个蛋白位点,直到第4-5周其所引起的条带略微下调。

2) Mp-IgG产生的免疫应答

Mp患者的血清中,在感染过程所识别的蛋白变化很大,但从感染至整个过程中持续引起IgG免疫应答的主要蛋白为168kDa。

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图5:Mp-IgM和Mp-IgG免疫应答过程中所识别的蛋白

3.

Mp的血清抗体的抗原策略

用于抗体检测试剂的Mp抗原选择非常重要,他决定了检测的敏感度和特异度,根据上述所列的抗体及抗体参与的免疫应答情况可知,目前主要的抗原为全菌体抗原和P1黏附蛋白。

1) 关于全菌体抗原

Mp全菌体裂解物(全菌体抗原):

包括细胞膜的糖脂、蛋白质等成分;涵盖抗原位点齐全,可用于Mp-IgM、Mp-IgG抗体检测。

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图6:肺炎支原体蛋白的结构示意图

2) 关于Mp-P1蛋白

Mp-P1蛋白能刺激机体产生较强烈的免疫应答,是Mp诊断的重要抗原;其中P1基因包含4881个核苷酸,可编码1627个氨基酸,其中包含了21个UGA密码子,在编码的过程中,UGA是终止密码子。因此重组蛋白无法获取P1蛋白的全长片段,通常以N端(P1-N1)和C端(P1-C1)区域为黏附蛋白的免疫区。

N端(P1-N1)分子量:13.9kDa;

C端(P1-C1)分子量:~39.7kDa;

在免疫印迹过程中发现,两者均能与单抗反应,患者血清只识别重组纯化C端(P1-C1)。

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图7:P1的基因组和P1不同片段反应

在重组表达的过程中,不同的提取方法获取的蛋白浓度不同;如下图:

1:大肠杆菌的空载体

2:大肠杆菌诱导表达重组P1的裂解物;

3:超声和离心后细胞裂解物的沉淀部分;

4:超声和离心后细胞裂解物的上清液;

5:色谱提纯;

6:凝胶过滤和色谱法提纯。

由此可知,其蛋白的纯度与提纯方式有关,色谱法可获取较高纯度的P1重组蛋白。

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图8:不同提纯方法的P1蛋白纯度情况

在同等的浓度168kDa的蛋白含量的反应过程中发现,Mp-IgG与P1蛋白的吸光值高于Mp-IgM,由此可知,P1蛋白与Mp-IgG的免疫应答反应性更高,更适用于于Mp-IgG检测。

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图9:P1蛋白与Mp-IgG和Mp-IgM的反应

在荷兰莱顿大学医学中心的研究中,比较了12种检测Mp-IgM和Mp-IgG抗体的检测试剂,结果表明,使用全菌体抗原的SerodiaMycoII、ImmunoWell和CFT的诊断性能比较高,使用富含P 1抗原的诊断Mp-IgM的性能不如含全菌体抗原,其中使用SERION全菌体抗原的CFT试剂检测Mp-IgM的准确度最高,其中ROC曲线也为最高。

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图10:不同抗原在Mp-IgG、Mp-IgM中的应用对比

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(五) 总结

综上所述,Mp是CAP的常见病原体,早期、快速、准确诊断是解决Mp感染的临床学若干问题的关键,合理的应用诊断策略和选择合适的抗原策略是提高Mp感染实验室诊断的必要条件,也是结合临床恰当诊治的重要前提。

作者:维润赛润 原料事业部

 

注:关于文章的任何疑问,请咨询作者邮箱:hillson.zhu@virion-serion.net

参考文献:

【1】 Pathogenesis of Mycoplasma pneumoniae: An update【2】 Diagnosis of Mycoplasma pneumoniae Pneumonia with Measurement of Specific Antibody-Secreting Cells

【3】 Rational stepwise approach for Mycoplasma pneumoniae pneumonia in children

【4】 lmmunoblotting patterns with Mycoplasma pneumoniae of serum specimens from infected and non-infected subjects

【5】 Expression and Immunological Characterization of the Carboxy-Terminal Region of the P1 Adhesin Protein of Mycoplasma pneumoniae

【6】 Reaction Pattern of Human Anti-Mycoplasma pneumoniae Antibodies in Enzyme-Linked Immunosorbent Assays and Immunoblotting

【7】 Production and characterization of recombinant P1 adhesin essential for adhesion, gliding, and antigenic variation in the human pathogenic bacterium, Mycoplasma pneumoniae

【8】 Evaluation of 12 Commercial Tests and the CoMplement Fixation Test for Mycoplasma pneumoniae-Specific Immunoglobulin G (IgG) and IgM Antibodies, with PCR Used as the “Gold Standard”

【9】 中国儿童肺炎支原体感染实验室诊断规范和临床实践专家共识(2019年)

【10】 儿童肺炎支原体呼吸道感染实验室诊断中国专家共识

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编辑:Steven | 校对:Harris | 责编:Hillson

 

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