维润赛润•德国

德国维润赛润（Institut Virion\Serion GmbH）成立于1978年，是国际知名的诊断产业生物原料、体外诊断试剂生产商和供应商。公司的研发和生产基地位于德国维尔茨堡，已通过DIN EN ISO 13485质量体系认证，拥有三级生物安全实验室(P3实验室)。经过40余年发展，公司构建了丰富的生物原料产品线和试剂产品。

维润赛润生物技术（深圳）有限公司是Institut Virion\Serion GmbH设立于中国的子公司。维润赛润（深圳）全面负责Virion\Serion产品在亚太地区的市场推广、商务合作、技术服务、应用研究。

小病毒，大市场–细小病毒B19抗体检测之抗原选择策略

添加时间：2021年9月7日

小病毒，大市场--细小病毒B19抗体检测之抗原选择策略

一、细小病毒检测概述

细小病毒B19（Human parvovirus B19），简称B19病毒，属细小病毒科，红细胞病毒属，是一种人群感染率高的单链DNA病毒。在1974年，B19病毒由澳大利亚病毒学家Cossart等在筛检献血者乙型肝炎病毒表面抗原时被发现，在1985年正式命名为B19病毒。

B19病毒主要经呼吸道传播，可在家庭和社区出现接触性传播，也可经母婴传播、血液制品及异基因造血干细胞移植传播。随着越来越多的研究发现，B19病毒感染的患者病情程度轻重不一，可从无症状隐性感染到多器官功能衰竭均可发生，甚至参与某些疾病的发生、发展，可导致心肌炎、肺炎、肝炎、肾小球肾炎等多种并发症；患者临床表现与其年龄、免疫及生理状态、是否妊娠等因素有关，如

1. 妊娠感染

妊娠期妇女：感染B19病毒可致流产或胎儿非免疫性水肿综合征。

2. 血液系统疾病

1) 免疫功能正常人群：红系造血一过性停滞；

2) 对于红系造血需求增加的溶血性贫血，如遗传性球形红细胞增多症、镰状细胞性贫血等患者：贫血加重，甚至发生再生障碍危象。

3. 非血液系统疾病

1）自身免疫性疾病

青少年和成年人：40%-80%感染B19病毒可出现自限性关节炎或关节病。

2）心肌损伤

感染B19病毒后导致冠状动脉内皮细胞功能异常、心肌缺血，并进展为心肌功能异常。

3）神经系统疾病

病因不明的急性脑膜炎患者可伴周围及中枢神经系统并发症，临床表现为神经痛性肌萎缩、格林巴利综合征、脑炎、脑病、脑膜脑炎等。

4）肝损伤

病原学不明肝炎患者，如无明显症状的单纯转氨酶升高、急性肝炎、急性爆发性肝炎等，在儿童中更为多见。

5）肾损伤

B19病毒感染可导致急性肾小球病变，可发生变异型局灶性节段性肾小球肾炎、溶血尿毒素综合征。

6）呼吸系统感染

主要表现为流涕、咽痛、肌肉疼痛等流感样症状，严重感染者可出现呼吸衰竭。

7）皮肤病变

典型皮肤改变为传染性红斑，表现为蕾丝花边样的网状红斑，中心呈颜色较浅的粉色斑疹；可引起中毒性表皮坏死松解症。

8）其他临床表现

坏死性血管炎、川崎病、过敏性紫癜、巨细胞行动脉炎、袜套综合征、慢性疲劳综合症。

4. 移植后B19病毒感染

实体器官移植和造血干细胞移植的B19病毒可从移植后数天至移植后2年均可发生，以贫血为主要临床表现。

5. 血液制品

血液制品在临床上应用广泛，因其原料的特殊性，具有潜在的病毒污染风险；近20年来，随着病毒安全性控制技术的进步，血液制品传播HIV、HBV、HCV等主要病毒的风险已得到有效控制；B19病毒等非脂包膜病毒已成为目前血液制品病毒安全性风险控制的焦点问题。

B19病毒感染检测的常用方法有血清学抗体检测、核酸检测以及抗原检测，其中B19病毒血清学抗体检测是目前B19病毒感染临床辅助诊断和流行病学调查研究的主要方法，用于对传染性红斑患者、或有B19病毒感染者接触史、不明原因发热、关节痛症状的高危对象进行检测。

二、细小病毒抗体检测试剂注册指导原则

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2021年4月15日，国家药监局发布了《人细小病毒B19 IgM/IgG抗体检测试剂注册技术指导原则》，在主要原材料研究资料中做出以下指导：

由于B19病毒不同的抗原（VP1或VP2）以及表位（线性或构象）类型对于IgM/IgG抗体的检出能力不同；因此在选择产品原料时，应注重上述抗原以及表位的选择，避免抗原或者表位的差异造成的假阴性。原材料研究资料中应详述此方面的考虑。另外，建议加入产品校准品。

三、细小病毒的结构及抗原选择策略

（一）B19病毒的蛋白结构

从指导原则上了解到，明确抗原的选择需要注意抗原及抗原的表位问题；根据B19病毒的蛋白结构可知，结构蛋白VP1和VP2分别占衣壳蛋白的4% 和96%，是病毒抗原的主要成分，也是中和抗体的主要结合区域；其中在昆虫细胞中表达的VP2可在无DNA或者NSP蛋白的情况下能够自组装形成病毒样颗粒（Virus-like particles, VLP），与天然病毒具有高度相似的外部结构和免疫原性；B19 病毒具有很强的嗜红系祖细胞的特性，不能在体外培养，当前以重组技术表达的VP1和VP2用于B19病毒检测和疫苗的应用。

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图1：B19病毒的结构蛋白示意图

（二）选构象表位抗原

抗原表位，又称抗原决定簇，指抗原分子中决定抗原特异性的特殊化学基团。根据抗原表位的结构不同可分为线性表位和构象表位。

1. 线性表位：

即连续性表位，它由4-6个邻近连续的氨基酸组成，存在于抗原分子任意部位，天然蛋白和变性后的蛋白均能鉴别出。

2. 构象表位

由序列上相连或不相连、但在空间结构上相互临近的氨基酸或多糖组成，一般存在于天然抗原分子表面，蛋白质变性后消失，不经加工处理即可直接被B细胞识别。

如在抗原与抗体结合的时候，抗原处于折叠状态，未分解小片段，即抗原氨基酸残基在序列上多处于不连续状态（也称空间表位）。

每一种天然蛋白质都有自己特有的空间结构或称三维结构，这种三维结构通常被称为蛋白质的构象；天然抗原包括线性表位和构象表位，以构象表位居多，如B细胞表位中超过90%的为构象表位，只有不到10%的为线性表位。

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图2：构象表位和线性表位的结构示意图

（三）B19病毒的血清动力学

在免疫功能正常的人群中，感染B19病毒后均能产生针对VP1和VP2的构象表位及线性表位的抗体，B19-IgM抗体产生于病毒感染7-12天后，并持续存在5个月或更长时间；B19-IgG抗体在病毒感染后10-12内产生，在体内可维持数年，B19-IgG抗体是既往感染的血清学标志物。研究表明，B19-IgM抗体和B19-IgG抗体对VP1和VP2抗原的构象表位与线性表位具有不同的反应性。

B19-IgM抗体：

针对VP1和VP2构象表位的特异性IgM产生较早，消失较晚，是感染初期的主要抗体，对针对VP2线性表位抗原表位的IgM抗体只在感染后一段很短的时期内能够检出。

B19-IgG抗体：

针对VP1和VP2构象表位的特异性IgG存在于B19感染的各个阶段并可以维持多年；而针对VP2线性表位抗原表位的IgG抗体只存在于B19感染的急性期，在既往感染患者中几乎无法检出。

因此，使用构象表位的抗原检测患者体内的抗体要明显优于使用线性表位抗原。

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图3：B19病毒的血清动力学

（四）B19病毒抗原选择的国际研究

2001年，意大利博洛尼亚大学的一项关于B19血清学的抗原研究，使用B19构象表位的VP2+VP1检测B19-IgM（ELISA法）的阳性率高达100%，使用B19构象表位的VP2检测B19-IgM（ELISA法）的阳性率高达95%，使用B19线性表位的VP1检测得到的阳性率为87%，使用B19线性表位的VP2检测得到的阳性率为46%；本研究建议，在检测B19-IgM抗体检测试剂的抗原选择上，构象表位优于线性表位，构象表位的VP2的检测阳性率已经非常高，当然，如果在追求更高质量要求的情况下，可以选择构象表位VP2+VP1进行组合。

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图4：使用B19的构象表位和线性表位的抗原检测已知B19 IgM阳性血清样本

1999年，在意大利博洛尼亚大学的一项研究中，比较B19不同感染时期的抗原免疫应答反应。结果显示，B19构象表位的VP2均与急性期、恢复期、既往感染的IgG发生强烈反应，而与无感染者不发生反应；线性表位的VP1和VP2在各个感染时期差异较大，值得注意的是，线性表位VP1在既往感染中产生23.7%-29.8%的假阴性；线性表位VP2在急性或既往感染中产生16.7%-91%的假阴性；与此同时，线性表位抗原在无感染者中可产生5%的假阳性反应。

在2004年，该课题组再次对B19血清学的抗原进行研究，使用B19构象表位的VP2+VP1检测B19-IgG（ELISA法）的阳性率高达98.6%，使用B19构象表位的VP2检测B19-IgG（ELISA法）的阳性率高达94.6%；由此可知，在检测B19-IgG抗体检测试剂的抗原选择上，构象表位也优于线性表位，构象表位VP2抗原与构象表位VP2+VP1的阳性率非常接近，因此，在B19-IgG抗体检测试剂的抗原选择上，构象表位VP2可以满足要求，如果追求更高质量要求的生产厂家可以选择构象表位的VP2+VP1。

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图5：B19在不同感染阶段的病毒学及血清型检测

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图6：使用B19的构象表位和线性表位的抗原检测已知B19 IgG阳性血清样本

（四）小结

综上所述，从B19病毒感染的血清动力学和B19病毒抗原的国际前沿研究可知，在检测B19-IgG和B19-IgM抗体检测试剂的抗原选择项目上，构象表位优于线性表位；B19病毒构象表位的结构蛋白VP2在体内体外均可自组装成病毒样颗粒(B19-VLP)，具有与天然病毒粒子相似的抗原性和免疫原性，能够有效的结合构象型抗体，是B19-IgG和B19-IgM抗体检测试剂的理想抗原，生产厂家也可根据生产要求选择组合抗原。

四、德国VirionSerion 抗原

1、抗原基本信息

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