诊断技术系列一：抗原抗体包被的策略简述

第十九届中国国际检验医学暨输血仪器试剂博览会（CACLP）

第二届中国国际IVD 上游原材料制造暨流通供应链博览会（CISCE）

CACLP展位号：B5-0805

展会时间：2022 年3 月27 日-3 月29 日

展会地点：南昌绿地国际博览中心

蛋白质在被修饰和固定后很容易失去其结构，从而失去其活性。使用抗体检测蛋白质本质上依赖于结合亲和力的保留，因此需要复杂的策略来保留生物识别元素。

抗体（或其片段）在固体支持物上的固定已经经过了广泛的研究，并在生命科学领域得到了广泛的应用。

在基于免疫测定的应用中，存在着成功利用抗体的关键参数。这些参数是抗体的大小、固定、方向、标记、灵敏度、选择性和稳定性。

然而，抗体的标记和固定是免疫测定发展的最关键因素，所采用的方法可能对测定产生深远的影响。

重组抗体是优化这些因素的一项有吸引力的技术，但对片段的化学修饰，如单链片段变量（scFv）会限制其更广泛的利用。基因修饰有利于改善这些参数中的几个，而且这样的新型抗体片段更适合固定化。

开发更敏感和稳健的系统的能力依赖于对卓越的检测特定抗体的改造，以改善这些累积的性能特征。

增强抗体的修饰能力和对后续应用的适用性对强大的生物传感器的开发具有战略意义。同样，以知识为导向的优化表面化学、固定化和连接的方法对于开发下一代的免疫测定系统是至关重要的，以便将其纳入高通量或多重平台，用于医疗点和其他分析应用。

对固定化的研究帮助了许多重要技术的发展，促进了快速基础研究工具和高级分析系统的发展，例如，亲和层析、生物传感器、免疫测定和蛋白质阵列。

基于抗体的免疫分析平台，如生物传感器，为传统的分析方法提供了一个快速和方便的替代方案。在一个理想的情况下，蛋白质以高浓度和适当的方向均匀地沉积在底物上，这样它们就能保持其活性，此外还能防止非特异性相互作用。

任何检测的敏感性的关键是活性抗体沉积在检测表面（如换能器表面或板表面），以及报告分子与二级抗体的有效耦合。

抗体固定方式决定了免疫分析表面上抗体的方向和活性。因此，沉积的抗体的数量和活性对免疫测定的灵敏度有影响。

有两种主要的抗体固定模式，被动和共价附着。

它们都依赖于抗体和希望共价附着的表面的化学特性。蛋白质在固体表面的吸附是迄今为止最简单的固定抗体的方法，但是采用这种方法时，随机取向和变性是重要的因素。为了将抗体化学地交联到表面上，需要双方都有官能团。

已经研究了许多化学方法来连接生物分子和免疫分析表面（图1），包括脂质层、硅烷层、聚合物层和自组装单层（SAM）。这些方法在选择的表面上产生了可用于进行固定化的悬垂功能团。

图1|将抗体连接到表面的偶联方法。经典的IgG结构是由两条重链和轻链组成。最关键的是，在可变的重链（红色）和轻链（绿色）结构域中的互补性决定区（CDRs）必须被保留下来，以便抗体与抗原的功能性结合。在自然状态下，抗体拥有初级胺、羧基和羟基作为抗体固定化的目标基团。胺基是抗体上最丰富的原生基团（如PDB数据库所述，整个抗体上大约有86个胺基），并且分布在整个抗体上。因此，这些是最常用于固定化的应用。此外，羧基是另一个可行的抗体功能化的基团。还有其他的功能基团在经过适当的处理后可以被利用。最常用的是巯基，它是通过用DTT或巯基乙醇以控制的方式还原抗体的二硫键产生的。过度的还原可能会导致抗体的所有四个结构域完全释放，从而导致活性的丧失。抗体的糖基化位点（红点）提供了一个可供选择的位点，可以用硼氢化钠氧化，生成垂悬的醛类，随后可以与胺功能化的表面结合。用具有反应性末端的聚合物嫁接的表面，如环氧基或甲苯基，可以通过胺或羟基直接与抗体连接。还有一些对固定抗体至关重要的策略，例如自组装单层（SAM）和聚电解质的逐层组装，这些策略也被用来通过静电相互作用和/或化学吸附在表面捕获抗体。

抗体也有几个官能团，已被用于固定化。垂悬的羧基和胺以及还原的硫（如水杨酸）和氧化的碳水化合物（如醛）是抗体上最常使用的本地功能团。为了捕捉功能化表面上的抗体，伯胺是最常见的目标基团。

然而，赖氨酸残基是伯胺的主要来源，它随机地分布在整个抗体上；这种非特异性的附着方式会导致抗体的失活，以及无序的表面（图1）。

这种随机的方法被证明具有两到三倍的抗原结合活性。抗体分子的消化和/或还原可以允许通过巯基的共价连接，通过半胱氨酸残基形成二硫键（氧化）的方式，在一个稍微特殊的部位。

最后，以碳水化合物分子为目标，产生活性醛（通过氧化），有利于与表面的胺（通过还原胺化）或肼激活的基团耦合。

在这些本地官能团的基础上，还报道了其他几种抗体功能化的方法。此外，标签也被用于将抗体固定在表面上。

标签通常是一个以共价方式连接到抗体上或以基因方式整合到抗体上的分子。每个标签都有一个高度特异性的结合伙伴，它被嫁接在感兴趣的表面上，因此，通过标签和它的伙伴之间的相互作用促进了抗体的固定化。

表1总结了一些常用的标签系统，它说明了一些实现抗体在表面定向固定的方法。

表1|常用的固定化抗体共轭物