第十九届中国国际检验医学暨输血仪器试剂博览会（CACLP）
第二届中国国际IVD 上游原材料制造暨流通供应链博览会（CISCE）
CACLP展位号：B5-0805
展会时间：2022 年3 月27 日-3 月29 日
展会地点：南昌绿地国际博览中心
05
抗体固定化的方面和案例研究
重组抗体技术正日益成为产生高度特异的、定制的、生物识别元素的首选方法。越来越多的重组抗体被开发出来，适用于环境分析、诊断和治疗（仅举几例），因此人们期待的重组抗体库的扩展正在实现。
对于他们的有序定位仍然存在许多挑战，因为通常减少抗体的面积会减少可用于连接的反应点的数量。然而，通过研究开发的许多策略已经确定了有序固定重组抗体片段的方法，但这通常是通过随机功能化实现的，这可能影响抗体抗原的活性。
Townsend和他的同事证明了重组抗体片段的结构形式和芯片功能化对小型非法药物结合物的检测有影响。这说明在基于SPR的分析中，格式和抗体会影响检测的灵敏度。融合蛋白作为固定化的媒介，在一些真正有序取向的应用中被证明是有用的。
为了快速色谱的目的，Blank和他的同事赞成使用甲壳素结合域（CBD）。抗体和CBD的融合允许直接从粗制的细菌裂解液中固定在甲壳素涂层的珠子上。
在首先突变CBD中自然存在的半胱氨酸以达到最大的细菌表达量之后，每个抗体分子使用一些CBD来实现固定化抗体的高稳定性。
这样的方法可用于免疫分析表面的抗体固定化，并结合了快速纯化和快速功能化。Kwon和他的同事证明了角蛋白酶介导的SAMs在抗体阵列上的潜力，它能保持抗体的反应性。
在该研究中，丝氨酸酯酶与表面结合的膦酸酯配体形成了一个特定位点的共价加合物。
在基于SPR的分析中，一些蛋白质被固定下来，也被证明在基于荧光的微阵列中是有效的。作者展示了一种制备具有可控抗体密度的相关芯片的操作策略。Scholler和同事们利用酵母交配来产生体外生物素化的抗体片段。
这些【生物抗体】是通过首先筛选抗HE4 scFv（卵巢癌标志物）库，然后与携带生物素连接酶序列的单倍体酵母交配产生的。生成的构建体很容易用于生物素化的生物碱表面，利用链霉菌素上的多个生物素结合位点来捕获生物体，以确定其特征。
在一个类似的方法中，Even- Desrumeaux和他的同事开发了一个基于珠子的夹心试验，使用新型的单域抗体片段（sdAbs），即来自骆驼的VHH域抗体。
在这项研究中，在大肠杆菌中实现了体内生物素化，促进了细菌裂解物的直接点化，以开发高通量的基于抗体的诊断阵列为目的的三明治测定。这种基于珠子的方法具有复用的潜力，对于低密度的临床诊断阵列是一种有吸引力的方法。
描述了用于检测阿特拉津污染的【可调控】免疫吸附剂，并利用了随着温度变化从可溶性到聚集性的可逆相变。
Kim和他的同事将弹性蛋白样多肽（EPL）与单链抗体（scAb）相融合，这有利于融合后的抗体在竞争性试验中与莠去津抗原相分离，而不需要固定试验中的任何元素。使用融合抗体进行的检测比单独使用scAb进行的相同检测的灵敏度高10倍。
这种方法规避了将聚合物与抗体进行化学连接的需要。然而，在这种情况下，ELP被融合在scAb的N端。为了使连接物远离结合位点，也许C端融合到人类Ck链上将是有意义的，特别是如果为涉及较大的抗原（如蛋白质）的检测而开发。
SNAP-标签利用了O（6）-烷基鸟嘌呤DNA烷基转移酶的快速、特异性偶联，从而使含有O（6）-苄基鸟嘌呤的底物通过硫醚键共价结合。Kampmeier和他的同事所展示的方法旨在凭借共轭作用扩大小型抗体片段的效用，而不影响结合。
这种方法已经成功地在一些场合得到了证明，从引入荧光体成像到荧光激活细胞分选（FACS），此外还有对非抗体配体（如CD40L）的标记。
利用游离半胱氨酸的反应性是有序固定化的一个有用方法。Brockmann和他的同事在scFv和Fab构建体中设计了一个游离半胱氨酸，以开发刺激甲状腺激素（TSH）的有序片段检测。
游离半胱氨酸与马来酰亚胺PEO2-生物素反应，并通过与链霉菌素的相互作用组装在表面。与完整的单克隆相比，表面结合的scFv和Fab分子能够敏感地检测TSH。
原因可能是与全长抗体相比，每单位面积的功能化表面可以捕获更多的scFv和Fab，从而允许捕获更多的抗原。在这种情况下，进行了【一体化检测】，具有良好的检测限。Liu和他的同事利用游离半胱氨酸进行基于scFv的Au纳米粒子的聚集。
在这种情况下，半胱氨酸被设计在scFv的连接区[72]。scFv稳定的纳米粒子的聚集允许比色检测，并有可能被应用于使用其他抗原特异性scFv的侧流式免疫分析。
另一种有趣的位点特异性方法是利用所谓的第21种氨基酸，硒半胱氨酸（Sec），这是一种半胱氨酸类似物，用含硒的硒醇基团代替了含硫的硫醇。
在这种情况下，有关大肠杆菌中具有游离半胱氨酸残基的可溶性蛋白质的低水平表达的问题被克服了。
在重组蛋白中，Sec的定向结合是通过一个顺式结构下游的UGA密码子实现的，该结构在哺乳动物系统中被称为硒半胱氨酸插入序列（SECIS），而在原核生物系统中也需要Sel操作子。
这使得其他重要的半胱氨酸残基得以保存，并允许加入一个有针对性的/定向的反应性手柄。Hofer和其他人已经表达了Fc-Sec变体以证明这种抗体衍生物在哺乳动物系统中的效用。
在这种方式下，马来酰亚胺化学被证明在DTT的存在下选择性地将Sec作为生物素衍生的目标，而在相同条件下不与游离半胱氨酸结合。
Hofer和同事用重组表达的完整的IgG-sec和Fab-sec构建体证明了这种方法，用于与一些具有治疗、蛋白质组学和诊断用途的分子相连接。在这种方法中，生物素-碘乙酰胺和生物素-马来酰亚胺被连接到抗体-sec重组体。
Rader和他的同事使用双半胱氨酸和硒半胱氨酸来允许装饰scFv-Fc构建体，特别适用于抗体药物结合物（ADC）。
在这些情况下，抗体与抗原的结合也没有被破坏。含有Sec是有利的，因为它有利于特定部位的共轭而不需要还原或修饰，具有很高的亲核反应性（共轭效率大于90%），保留了天然的二硫键并具有可控的化学计量。
鉴于许多荧光体和表面都存在共轭所需的化学反应，将这种蛋白质纳入免疫测定平台似乎有潜力。
重组抗体在免疫测定表面的部署正在形成势头，因为所选择的抗体正变得真正的超敏感，并为这种测定格式量身定做。
重组抗体不一定来自于亲代单克隆抗体，而是来自于几乎任何物种和天然来源的免疫复合物。
这些重组抗体被设计成具有高亲和力和针对许多重要疾病目标的关键表位，被迅速设计以克服与随机固定有关的问题。因此，表面变得更加均匀，并含有高容量的功能完整的生物识别分子，以支持更高灵敏度的免疫测定的发展。
06
结论和未来展望
蛋白质是脆弱的分子，抗体作为生物识别元素，必须在有利于保留其活性的条件下进行处理，并促进足够密度的固定在正确的方向上，以支持新型免疫分析的发展。噬菌体、核糖体和酵母菌展示正在产生用于诊断的新型抗体。
这些重组格式是有优势的。一旦建立，它们可以相对便宜地生产和设计。新的底物表面化学和连接方法正在推进我们部署这些试剂的能力，然而，没有一种领先的方法可以满足所有的分析要求，这对开发免疫测定是至关重要的。
推进我们对表面化学的认识，整合表面科学、生物学和化学，重点开发与生理有关的生物材料，对生产下一代免疫测定至关重要。
在改进免疫诊断方法方面已经取得了相当大的进展，这些进展主要集中在表面制备、微流控设计、抗体固定化策略和信号增强方法。
正如所讨论的，抗体固定化策略是该过程的一个关键组成部分，对检测性能有重大贡献。这些进展加上高质量、高特异性的抗体，以及一系列人类和动物健康的重要指标，有可能导致下一代免疫诊断设备的出现。
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