【论著】肺炎支原体实验室诊断方法的临床价值评估

1.1　一般资料
1.1.1　实验组　采集2017年3月至5月北京市朝阳区3~5岁幼儿园健康体检儿童的咽拭子样本349例。男198例，女151例，平均年龄4.3岁。入组标准：（1）1个月内无发热、咳嗽等呼吸道感染症状；（2）身高、体质量正常；（3）五官发育良好，无严重视力、听力、口腔等问题；（4）无先天性免疫缺陷及其他系统疾病。
1.1.2　MP感染患儿　采集2016年12月至2017年1月中国医科大学附属盛京医院临床诊断为MP感染患儿93例的咽拭子及急性期、恢复期双份血清。参考菌株选用FH国际标准株（ATCC15531），购自美国ATCC公司。入组标准：（1）发热或无发热，咳嗽（持续剧烈咳嗽为主要表现，无痰或少痰），或伴呼吸困难、喘憋等；（2）肺部听诊音粗或闻及干湿性啰音；（3）血清检测 MP-IgM 抗体、MP-PCR、MP培养，三者之一阳性；（4）胸部X线片无明显影像学改变，或肺部体征较显著，可表现为肺门阴影增重、支气管炎、间质性肺炎、均一的肺实变、肺不张等。排除标准：（1）出现多系统、多器官损害者；（2）患严重肝、肾、心血管及造血系统疾病、免疫系统疾病，以及精神病患儿。将入组患儿分为<3岁组，3~5岁组和>5岁组。本研究通过首都医科大学附属北京友谊医院伦理委员会批准（批准文号：2015-p2-022-01)。
1.2　方法
1.2.1　MP分离培养　接种于胸膜炎微生物（PPLO）培养基，于孵箱内孵育观察，以指示剂颜色变化作为判断MP生长指标。培养基颜色变化后，收集菌株，提取DNA，采用荧光定量PCR（qPCR）扩增DNA并测序，测序结果与基因库DNA序列比对，判定是否为MP。
1.2.2　qPCR检测MP-DNA　采用通用型柱式基因组提取试剂盒（货号CW2298，生产厂家：江苏康为世纪生物科技有限公司）提取基因组DNA，步骤按说明书进行，MP-DNA的检测采用qPCR，SYBR Green 染料法进行qPCR，以反应荧光信号达到阈值时的Ct值作为判定标准，将判定阳性的标本测序，测序结果与基因库对比^［4］。
1.2.3　RNA恒温扩增实时荧光检测（simultaneous amplification and testing,SAT）　采用MP核酸检测（RNA恒温扩增）试剂盒（FYM-SAT）（货号：YZB/国3229-2013，生产厂家：上海仁度生物科技有限公司）检测，操作步骤按说明书进行。
1.2.4　酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）检测MP特异性IgM抗体　采用serion ELISA classic肺炎支原体IgM抗体定量检测试剂盒（货号：SCG.AO，生产厂家：Virion＼serion德国）检测，操作步骤按照说明书进行。
1.2.5　被动凝集法（passive agglutination,PA）检测血清中特异性抗体滴度　采用赛乐迪亚^®-麦可 Ⅱ (SERODIA^®-MYCO  Ⅱ )（货号：YZB/JAP8033-2013，生产厂家：日本富士瑞必欧株式会社）检测MP混合抗体滴度，操作步骤按照说明书进行。
以双份血清MP特异性抗体滴度的4倍变化为金标准^［5］。
1.3　统计学处理　采用SPSS 19.0统计学软件进行数据分析，计量资料以x̄±s表示，计数资料组间的差异比较采用χ²检验或Fisher′s检验，绘制受试者工作特征（ROC）曲线将目前几种实验室检测方法与参考标准进行比较，计算曲线下面积（AUC），评估几种实验室检测方法的临床应用价值。P<0.05为差异有统计学意义。

2.1　健康儿童MP检测情况　健康儿童咽拭子样本349例，qPCR检出MP阳性例数66例，阳性率为18.9%；分离培养2例，阳性率为0.6%。
2.2　MP感染患儿检测情况　患儿93例，其中男42例（45.2%），女51例（54.8%），平均年龄为5.5岁（3~14岁）。咽拭子与急性期血清采集于病程1周左右，恢复期血清采集于病程第2-3周。以双份血清抗体滴度的4倍变化为确诊金标准，男女患儿MP检出率分别为59.5%、68.6%，差异无统计学意义（P=0.361）。3个年龄组患儿男女检出例数（1/6例比2/7例，11/20例比14/21例，13/16例比19/23例）比较，差异均无统计学意义（P=0.612、0.444、0.913）。3个年龄组患儿的MP检出率分别为23.08%、60.98%、82.05%，差异均有统计学意义（<3岁组与>5岁组比较：P<0.001，<3岁组与3~5岁组比较：P=0.017， 3~5岁组与>5岁组比较：P=0.037）。
2.3　几种实验室检测方法与参考标准比较　检出MP感染患儿60例（64.5%），培养阳性39例（41.9%），qPCR阳性68例（73.1%），SAT阳性59例（63.4%）。与金标准比较，qPCR敏感性最高（93.3%），特异性较低（63.6%）；培养的特异性最高（100.0%），敏感性低（65.0%），易造成漏诊，培养周期为14~21 d，甚至更长，不适于早期诊断。SAT有相对较高的敏感性（85.0%）和特异性（75.7%）。PA检测急性期单份血清，检出阳性43例，敏感性71.7%；PA检测急性期单份血清结合qPCR敏感度提升至100.0%，特异性为63.6%；结合SAT敏感性提升至95.0%，特异性为75.7%，总符合率、约登指数、Kappa值均最高。结果见表1。将培养、PA检测单份血清、ELISA、qPCR、SAT与金标准比较，结果见表2、图1；将PA检测单份血清分别与qPCR、SAT结合，与金标准比较，绘制ROC曲线如图2所示。综合各指标认为检测急性期血清结合SAT为最优诊断方法。

2.4　血清学检测方法的最佳诊断界值　以双份血清4倍升高或下降为金标准，以ELISA方法检测急性期单份血清抗体含量为研究对象，绘制ROC曲线，结果显示阳性界值定为27 U/mL较界值为17 U/mL时（试剂盒设定阳性判定标准）诊断价值略提高（AUC=0.911，P<0.001，95%CI：0.847~0.975）（图3）。以PA检测单份血清抗体滴度为试验组，绘制ROC曲线，结果显示以单次检测血清MP特异性抗体滴度≥1∶160诊断MP感染敏感性略低，以此值为诊断标准，可能会造成漏诊，1∶80 为最佳诊断界值（AUC=0.896，P<0.001，95%CI：0.824~0.967）（图4）。

MP感染是儿童CAP的重要病原，发病率较高，临床表现缺乏特异性，实验室诊断成为明确病原、指导临床用药的重要辅助检查，如何选择早期、快速、准确性高的诊断方法是实验室诊断面临的主要挑战。
MP存在无症状感染或感染后携带现象，本研究采集健康儿童349例咽拭子标本分别进行培养及qPCR，均有阳性检出，无临床症状与机体病原载量及免疫状态相关。国外文献报道MP无症状携带率可达0.1%~56.0%^［6］。国内文献报道当MP载量>10⁷ copies/μL才更易引起高热，低载量与发病的关系尚未明确^［7-8］。
分离培养特异性高，曾被认为是诊断MP感染的金标准，但因其需要特殊的培养基及实验室条件，生长周期较长，多应用于科学研究。本研究结果显示，培养特异性可达100.0%，但敏感性仅为65.0%，略高于既往文献报道的3%~64%^［9］，可能与采样时间及本研究入组患儿多为住院患儿有关。本研究MP培养周期为 2~3周，无法满足临床快速诊断的需求。
血清学检测方法是诊断MP感染的常用方法，目前常用的血清学检测方法包括ELISA、PA等，国际上认为双份血清MP特异性抗体4倍升高或降低可确诊MP感染^［10-12］。检测双份血清诊断MP感染敏感性可达 39%~88%^［13］，但2次采血需间隔2周，双份血清采集率较低，无法满足临床快速诊断的需求，因此目前临床多检测急性期单份血清作为临床诊断参考指标。既往研究中检测急性期单份血清敏感性仅约30%^［14］，本研究中PA检测急性期单份血清敏感性可达71.7%，ELISA法检测急性期单份血清，敏感性为86.5%，明显高于既往报道，考虑与本研究中样本多采集于病程1周左右有关。但文献报道MP感染后抗体可持续阳性数月，既往感染可产生假阳性结果^［15］；另有文献采用4种商品试剂盒检测102名健康志愿者血清，MP-IgM、MP-IgA也均有阳性检出^［16］，因此本研究认为临床仅能检测单份血清时，于病程１周左右采集，阳性率更高，但检测阳性并不能作为MP现症感染的确诊依据，是否需要针对MP治疗需结合临床。本研究结果显示，ELISA法与金标准比较，试剂盒所示阳性判定标准低于ROC曲线显示最佳诊断值，单纯采用此方法诊断MP感染存在一定假阳性率，或造成过度诊断。我国关于MP感染诊断的专家共识推荐单次血清检测MP特异性抗体滴度≥1∶160作为MP感染的确诊依据^［5］，但本研究ROC曲线显示，此界值稍高于最佳诊断点，易造漏诊，考虑原因为本研究样本数较少，建议进一步扩大样本量进行评估。
分子生物学检测方法简单、快速、敏感性较高，对于年龄较小的婴幼儿，分子生物学检测方法更具优势^［17］。本研究结果显示，qPCR检测的敏感性、特异性均优于市售试剂盒^［18］，但特异性仍较低，分析原因为：（1）MP存在无症状感染或感染后携带现象。本研究检测健康儿童，MP检出率为18.9%。国外亦有研究认为MP可在呼吸道存在数月而不引起发病^［4］。（2）MP-DNA可在感染后持续检出，长达7周~7个月^［19］，因此DNA检测阳性不能作为是否需要治疗的依据。本研究选取SAT方法检测MP-RNA，亦有较高的敏感性和特异性，但略低于ｑPCR。亦有研究显示，SAT与qPCR检测MP有较高的符合率（Kappa=0.97）^［20］，与本研究存在差异，分析原因认为RNA 较DNA易降解，更易受采样时间保存方式等影响^［21］，且本研究中入组患儿采样时多数已接受治疗，可能影响MP检出率。检测RNA较DNA特异性提高，可能与RNA较DNA更能反映病原体的生存有关，但本试剂盒检测的为总RNA，而非信使RNA，不能区分现症感染与感染后携带。本研究认为，病程早期分子生物学检测MP感染敏感、快速，符合临床需求，随着病程发展，尤其在应用抗生素后，血清学检测方法较分子生物学更具优势^［22］。
血清与分子生物学诊断相结合检测MP感染，是目前学者常推荐采用的诊断方法^［22-23］。本研究结果显示,急性期单份血清结合SAT检测MP-RNA，敏感性有较大提高（95.0%），且因RNA易降解，较检测DNA特异性高，诊断的准确性优于单独应用一种方法，为本研究最优诊断方法。
综上，目前实验室检测方法均有各自的局限性，采用任何一种方法诊断MP感染均需结合临床。分子生物学诊断方法特异性相对不足，继续研究MP载量与发病的关系，或能解决此问题。PA检测急性期单份血清可为临床诊断提供参考，探讨单份血清抗体滴度的最佳界值可能有利于提高诊断的敏感性。急性期单份血清结合分子生物学检测方法能提高诊断准确性，建议有条件的单位采用2种诊断方法结合临床综合判断。