【大咖谈技术】免疫测试中信号的产生

添加时间:2023年5月12日

【大咖谈技术】免疫测试中信号的产生

这是一个技术专栏,在这个专栏当中,由全球诊断技术大咖为大家带来诊断技术开发方面的技术谈谈,我们非常有幸邀请到了Dublin City University的Caroline Murphy博士为带来关于免疫测试的讲解。

检测方法可以分为“标记的”和“无标记的”信号系统。使用与酶、荧光标记、放射性标记、比色标记或纳米粒子相连的抗体的免疫测试被归类为“标记的”(表1和表2)。

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信号产生

最早的抗体检测系统采用了放射性标签。Rosalyn Yalow和Solomon Aaron Berson在20世纪50年代报告了在检测胰岛素的实验中首次使用放射性标签。与放射性工作相关的危险的工作条件、废物处理和潜在的健康问题导致了替代检测系统的加速发展。

目前的技术更安全,不会对使用者造成重大的健康风险,而且产生的废物可以在最小的不便下进行处理。今天,放射性标签已经被使用更安全的方法提供高灵敏度的检测方法所取代,这些方法将在以下各节中详细讨论。

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1.1|酶联免疫法

酶联免疫法是一种用于测量溶液中有色化合物的技术。在酶的作用下,致色底物产生彩色化合物。过氧化物酶是一种小的酶(大约40kDa),在其底物和氧化剂过氧化氢存在的情况下,可以用来产生可读的信号。

过氧化物酶可用于帮助生成发色底物(使用3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(TMB)或2,2′-氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(APTS))或光(使用增强化学发光(ECL)底物)。

过氧化物酶有许多异构体,在生物技术和生物化学应用中最常用的是植物过氧化物酶,如辣根过氧化物酶(HRP)和大豆过氧化物酶(SRP)。为了进一步提高过氧化物酶在工业环境中的效用,Loughran等人进行了一项有趣的研究。

作者复活了一个1.1亿年前的活性祖先植物过氧化物酶基因,称为“祖父”(GP)。人们认为,在1.1亿年的进化过程中,一些酶的特性可能已经丧失。Loughran等人将GP的特性与现有的过氧化物酶、HRP同功酶A2、HRP同功酶C和SBP进行了比较。

结果发现,GP显示出适度的热稳定性,但在增加对H2O2的耐受性方面超过了现有的过氧化物酶,这是生物技术工业中的一个理想属性。

使用过氧化物酶作为酶标的一个优点是它的体积小,在与抗体结合时很少造成立体障碍(通常以4:1的比例)。它的局限性在于,过氧化物酶反应需要H2O2的底物,并且与含有叠氮钠或金属的缓冲液不相容,因为它们会使过氧化物酶失活。

碱性磷酸酶(AP)是一种可供选择的产生信号的酶标。它的分子量约为86kDa。由于其较大的尺寸,用AP标记抗体时必须小心,以确保结合水平不妨碍抗原结合。

AP比过氧化物酶更昂贵,但它更稳定。使用AP的一个缺点是它在酸性条件下(pH<4.5),在螯合剂或无机缓冲液中会失去活性。

然而,这些属性可以有利地用作反应停止机制。AP的底物是无毒和相对稳定的,例如对硝基苯磷酸酯(PNPP)在4℃下可稳定几个月(表2)。

1.2|发光

发光是指电子激发的分子以可见光的形式释放能量。当被激发的分子返回到基态时,它会释放出一个光子。发光的“总称”涵盖了一系列的检测系统,包括化学发光、磷光、生物发光和荧光。

1.2.1 化学发光

化学发光是指化学反应的能量以光的形式释放,不需要光源的激发(与荧光不同)。发光化合物产生的光子可以在很短的时间内被激发,所达到的灵敏度可以高于传统标签所达到的灵敏度。在表2中给出了化学标签的例子。

可以选择两种方法:

1) 使用化学标记的底物,该底物会转化为化学发光产物;

2) 使用直接附着在抗体上的化学发光分子。

用产生化学发光的酶标记配体(如抗体)经常被使用,因为它可以启动多个化学发光反应,使反应高度敏感。

另外,化学发光化合物可以被共价标记到互补的结合伙伴之一。这是一个直接的方法,然而,存在的化学发光标签不多,而且抗体上的表面空间通常有限,无法容纳多个标签。

化学发光检测系统的优点包括:快速发光、动态范围广、试剂稳定性高、昂贵的试剂消耗低、孵化时间短、灵敏度高、消除背景效应和毒性低。

1.2.2、生物发光

生物发光是指生物反应产生光的现象。由于其独特的特性,生物发光在用于免疫测试时常常被证明是有利的,因为它与荧光不同,几乎没有相关的背景,而且它具有高的量子产率和快速的反应动力学。

许多明亮的光蛋白在最黑暗的地方被发现。Aqueorin最初是在水母Aequoria victoria中发现的,它是一个稳定的复合物,由一个凋亡蛋白(apoaequorin)、一个发色团(coelenterazine)和分子氧组成。

重组的aequorin已经成功地用于免疫测试,检测激素皮质醇。重组的aequorin与皮质醇以不同的摩尔比进行化学共轭,所得共轭物被评估为最高水平的生物发光。

开发包含aequorin的嵌合抗体也已被证明是有用的。apoaequorin基因被亚克隆到哺乳动物的表达载体中,抗体的恒定结构域被光蛋白取代。这种方法比用化学方法将光蛋白连接到抗体上更可靠,因为化学修饰往往会导致“批次间”的变化或抗体结合活性的丧失。

当aequorin在1962年首次被发现时,Shimomura等人同时发现了第二种蛋白质,它也成为一种基本的生物成像工具。

绿色荧光蛋白(GFP)已被经常用作基因编码的荧光标记。荧光蛋白(FP)家族已经扩展到1000多个变体形式,每个变体表现出不同的激发和发射波长,因此,都显示出不同的颜色(如单体橙(mOrange)(激发548纳米/发射562纳米)到mRuby(前558纳米/后605纳米))。

1.2.3、荧光

荧光是一种现象,当电磁能量(光子)被物质吸收,从而激活其电子并将其提升到更高的能量状态时,就会发生荧光。

恢复到基态的能量导致能量以光的形式释放,称为荧光。荧光只在物质吸收光的时候发生,然而,荧光分子可以再次被激发,从而继续循环。

发出的荧光的波长比激发的波长长,波长的变化被称为“斯托克斯位移”。这种波长的变化是由于电子被激发和能量释放为荧光之间的能量损失而发生的。斯托克斯位移 “的程度取决于荧光体的固有电子结构。

荧光体在一定的波长范围内被激发。分子被激发得最理想的波长被称为激发最大值。同样地,荧光团在一定的波长范围内发出荧光。

发射最大值是荧光团发出的光(荧光)最强烈的波长。由于荧光团在一定的波长范围内吸收和发射,所以选择两个具有明显激发和发射峰值的荧光团是很重要的,这样它们就不会重叠,可以单独检测。

荧光分子可用于荧光免疫测试,作为酶联免疫法的替代读数。可以利用荧光底物代替TMB或PNPP作为AP、β-半乳糖苷酶和HRP检测酶的底物(之前在表2中列出)。

荧光信号的产生受到许多不同参数的影响,包括pH值、温度、离子浓度、干燥、光散射、淬灭和漂白,在实验过程中必须考虑到这些因素。

 2

用于信号产生和固定的纳米材料

纳米大小的实体(1~100纳米之间)在免疫分析中越来越普遍,用于检测和固定。它们允许非常低的检测水平,并且越来越多地被用于“医疗点”诊断。

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图1 | 量子点(QD)结构显示了内芯和外壳。可用于QD的内芯材料包括硫化锌(ZnS)、硫化镉(CdS)、硒化锌(ZnSe)、碲化镉(CdTe)、硫化铅(PbS)、PbSe/Te和CdSe/Te以及镉汞/碲(CdHg/Te)合金。外层核心通常是ZnS。QD被高分子涂层所包围,增加了水溶性并有利于抗体/抗原的结合。

量子点(QDs)是由半导体材料组成的荧光纳米结构,目前正被用于广泛的生物成像技术。它们最早是由Ekimov和Onushchenko在1980年发现的,他们发现QDs可以根据其大小产生一系列的荧光信号。

目前,QDs可以根据其组成分为三个不同的类别。

首先,“芯型”QDs由单一材料组成,例如硒化镉(CdSe)或硫化镉(CdS);

其次,“核壳型”QDs由两种半导体材料组成,一种“内核”材料嵌入“外壳”材料中(图1)。这些“核壳”QD显示出比“核型”QD更好的亮度和量子产量。

最后,第三种类型的QD是 “合金 “QD,由硒化锌-硒化镉(ZnSe-CdSe)组成。合金QD是独特的,因为它们的荧光特性可以在不改变QD尺寸的情况下被改变。合金成分比例的改变促进了颜色的改变。

QD已经成为疾病检测和诊断领域的一种新资源,并已被用于许多生物检测,如基于荧光共振能量转移(FRET)的传感、细胞成像和免疫检测。

许多QD的属性已经被确定,以区别于荧光有机染料或蛋白质荧光团。这些包括:

  • 广泛的激发光谱;

  • 窄尺寸可调的光致发光发射光谱;

  • 大的斯托克斯偏移;

  • 高量子产率;

  • 增加了光稳定性(比荧光染料);

  • 非常适用于多色应用;

  • 不同种群的QDs可以被单一的激发波长所激发;

  • 在连续照明下具有更高的抗光漂白性。

金纳米粒子(AuNPs或GNPs),由于其长时间的稳定性,已经越来越受欢迎。它们固有的高电子密度使它们很容易被广泛的分析技术检测到,例如原子力显微镜(ATM)、傅里叶变换红外光谱(FT-IR)和扫描电子显微镜(SEM)。

根据其大小,AuNPs产生不同的颜色;如果小于100纳米,AuNPs是红色的,而大于100纳米,AuNPs是淡黄色的。由于AuNPs与抗体非共价连接,其坚固的性质、稳定性和产生强烈颜色的能力,已经成功地整合到了侧向流免疫分析中。

碳纳米管(CNTs)是由一层(单壁纳米管(SWNT))或多层石墨烯(多壁纳米管(MWNT))组成的碳圆柱体。越来越多的CNT被用于工业应用,显示出比典型工业纤维高10倍的抗拉强度。

CNTs在本质上可以是金属的或半导体的,并且可以作为抗体支持。Wan和他的同事已经开发了它们作为免疫感应标签的潜在用途,并利用它们的信号传导能力。

一个通用的MWNT,共价地涂有HRP和山羊抗兔,被用作一个通用的基于电化学的检测器来检测癌症标志物、前列腺特异性抗原(PSA)和白细胞介素-8(IL-8)的存在。

该系统提供了非常低水平的PSA和IL-8的检测(分别为5 pg/mL和8 pg/mL)。然而,所涉及的众多步骤使其成为相当密集的劳动。

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编辑:Jason | 校对:Harris | 责编:Hillson

 
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德国维润赛润(Institut VirionSerion GmbH)成立于1978年,是国际知名的诊断产业原料生产商和供应商。公司的研发和生产基地位于德国维尔茨堡,已通过DIN EN ISO 13485质量体系认证,拥有三级生物安全实验室(P3实验室)。经过了40余年的发展,公司构建了丰富的生物原料产品线,主要包括天然抗原、重组抗原、人源化单克隆抗体和磁珠等。

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