侧向免疫层析开发方案（很实用）

基于免疫层析原理的侧向层析测定早作为诊断和预后工具中表现出广泛的应用。侧向层析测定的目标分析物包括传染病制剂、滥用药物、激素、癌症标志物、食品污染物和农业污染物[1, 2]。硝化纤维膜的测试线和质控线中的抗原和抗体反应导致的颜色形成提供了分析物的定性检测。定性检测可以通过定制设备转化为定量检测，这些设备可以将颜色强度或荧光量化。侧向免疫层析测定（LFIA）是一种经济实惠的技术，旨在于5-30分钟的短时间内快速检测分析物[3, 4]。

LFIAs的开发的重点主要在于抗原抗体的相互作用的膜特性的标准化方面。毛细管流速主要取决于膜的物理和化学特性。检测的特异性和灵敏度取决于捕获和检测抗体的表位特异性以及检测抗体与胶体金纳米粒子的生物结合效率。条状试剂的设计包括按样品垫、结合垫、硝化纤维素膜和吸收垫的顺序重叠排列的膜。当我们将全血样品作为分析物时，还需要使用额外的膜来分离血细胞和清除背景。一个典型的LFIA条带由上述的膜组成，依次排列在塑料背板上的条带，并被放置在特殊设计的卡盒中，以保证适当的流速和稳定性（图1a，b）。

硝化纤维素（NC）膜被认为是快速检测条的骨架，测试线和质控线的捕获抗体被涂在这里。在确定硝化纤维素膜的孔径时，必须考虑分析物的大小和样品类型（全血、血清、血浆、尿液）。随着孔径的增加，膜的流速也会增加。检测的灵敏度与孔径大小成反比。NC膜本质上是中性的，可以通过硝酸酯与蛋白质的肽键之间的偶极-偶极作用与蛋白质静电结合。捕获试剂的缓冲液的pH值必须根据所用蛋白质的等电点进行优化，以增强静电作用。

NC膜的孔径范围为1-20 μm，根据分析物的特性来选择。NC膜可以根据孔径大小或吸水时间来评定。随着孔径的减小，吸水时间增加，为抗原-抗体提供足够的相互作用时间，从而提高检测的灵敏度。根据我们的经验，建议HCG使用10 μm的膜，疟疾和登革热快速检测使用15 μm的膜。通常NC膜的长度为20-25 mm，宽度为3-4 mm。测试线涂层与样品垫的距离应至少为7 mm，测试线与质控线之间的距离应至少为5 mm。由于NC膜容易受潮，所以应始终保持相对湿度（RH）低于40%的干燥状态。在检测的发展过程中，最好将NC膜保持在25℃，RH<40%的控制环境中，以获得一致的结果。一旦捕获试剂被涂在膜上，就必须使用真空干燥或37℃热风炉干燥1小时，甚至使用空气干燥器进行干燥。真空干燥不是首选，因为它对批量干燥来说是很困难的。37℃的热风炉中干燥1小时是合适的，因为大多数蛋白质可以在37℃的温度下不变性。

纤维素或玻璃纤维被认为是合适的样品垫，作为样品分析的平台。最好是用玻璃纤维作为样品垫，因为它的蛋白质密度低，吸收能力强，能提供稳定而均匀的样品流向结合垫。样品垫是LFIA中预处理的主要部位，用于减少背景噪音和非特定的相互作用。预处理包括添加阻断剂如BSA（1%）、酪蛋白（0.1-0.5%）、明胶（0.05-0.1%）和表面活性剂如Tween-20（0.05%）、Triton X-100（0.05%）。用上述阻断剂和表面活性剂预处理过的样品垫（最好是在碳酸盐缓冲液或三相缓冲液中），然后在60-70℃的热风炉中干燥1小时。如果是全血样品，细胞分离膜用于支持样品垫，并与结合垫重合。

玻璃纤维、纤维素薄膜和聚酯被用作结合垫的材料。结合垫是纳米粒子/微粒子与检测抗体/抗原结合的位置。它应该具有低蛋白结合性和高释放能力。浸渍和喷洒是用来将检测试剂涂在结合垫上的方法。应注意检测器颗粒在结合垫上的均匀扩散。浸泡过的垫子可以在37℃下干燥1小时，也可以用手持式空气干燥器进行干燥。结合垫是LFIA的一个重要组成部分，与NC膜一样重要。检测抗体结合的稳定性和释放动力学直接关系到检测的灵敏度。

吸收垫的常用材料是纤维素薄膜，其性质是高度极性的。它被放置在条带的下端，吸收膜上的全部溶液，提供最大的背景清除。在某种程度上，可以通过调整吸收垫的厚度和长度来提高检测的灵敏度。增加吸收垫的厚度可以解决试纸条中的回流问题。

大多数LFIA都是基于免疫测定（夹心法）来检测体液中的抗体/抗原分析物。对于抗原检测来说，必须选择捕获抗体和检测抗体，以使表位结合位点彼此相距较远。一旦选择了捕获抗体，就必须将其涂在NC膜上。与其他免疫测定相比，LFIA对捕获抗体的浓度要求更高，每条的浓度从50到500 ng不等（条宽宽3-4 mm）。缓冲液的摩尔值和pH值对捕获抗体在干燥膜上的正确包被和稳定性有很大的影响。磷酸盐缓冲液或碳酸氢盐缓冲液是常用的，pH值必须根据蛋白质的等电点来优化。单克隆抗体是首选的捕获抗体，缓冲液的摩尔值应保持在较高的水平，以使分析物有适当的互动。为了增加捕获抗体在NC膜上的结合，可以在捕获试剂中使用1-3%的甲醇。

检测试剂负责LFIA中颜色的形成，这是因为在免疫测定（夹心法）反应中发生了纳米颗粒的聚集。金纳米粒子是广泛使用的与抗体结合的材料，因为它具有惰性和完美的球形结构。彩色乳胶微粒子、银纳米粒子、石墨烯纳米粒子也可用于LFIA的检测试剂制备。柠檬酸三钠还原法是制备胶体金纳米粒子的既定方法，纳米粒子的大小可以通过改变柠檬酸三钠的浓度来定制。通常情况下，20-80 nm的纳米颗粒被用于结合目的，40 nm是最好的选择。颗粒大小的变化可以通过分光光度计的吸光度扫描进行分析。纳米颗粒的颜色会随着尺寸的改变而改变（具体请见表1）。

检测抗体与金纳米粒子的结合效率可以被认为是成功开发LFIA的速度限制过程。结合缓冲液的pH值必须被优化，以使抗体分子完全与胶体金颗粒结合。pH值的优化是通过在2M氯化钠的存在下，在不同的pH值梯度下，将抗体和胶体金纳米粒子的结合缓冲液混合时检查聚集反应来进行的。在最佳的pH值下，所有的胶体金颗粒都同样被检测抗体结合，缓冲液中没有自由的金颗粒。如果pH值不理想，缓冲液中的游离金颗粒会与2M氯化钠发生反应，导致黑色的聚集反应（表2）。

结合反应后，抗体包被的胶体金应该用阻断剂如牛血清白蛋白（1%）或明胶（0.5%）进行阻断。最后的储存缓冲液含有稳定剂如海藻糖（1-5%）或蔗糖（5-20%）。一旦准备好，抗体结合的胶体金溶液必须根据吸光度OD在储存缓冲液中稀释，然后涂在结合垫上，在37℃下干燥。常用的吸光度OD值为OD 10。结合抗体应在温度<25℃，相对湿度<20%的条件下保存。在控制湿度的条件下，干燥的检测试剂在结合垫上的稳定性可达3年。液体形式的结合检测试剂在4℃下最多可稳定1个月。