经验分享：谈谈IVD中的防腐剂
添加时间：2022年7月1日
为提高诊断试剂盒的稳定性，在生产过程中通常需要加入防腐剂。这些试剂的质量将会影响成品试剂盒的性能。 诊断试剂盒中的组分，比如试剂和标准品，均可被微生物分解，因此容易受到微生物的污染。为了提高试剂盒的存储稳定性，在生产过程中必须添加防腐剂。然而，要找到适合诊断试剂盒生产所需的防腐剂是件非常困难的事情。因为该防腐剂除了有效的抗细菌、酵母和真菌的性能外，还必须不能影响试剂盒中各组分的活性。防腐剂会使酶、抗体、抗原等蛋白类物质变性或破坏其免疫结构。另外，防腐剂还会造成竞争性抑制，例如抑制酶和底物的结合、抗体和抗原的结合等。因此，在诊断试剂盒的开发过程中，选择合适的防腐剂是非常重要的一个步骤。 防腐剂在诊断试剂盒中用作保护剂。为获得最佳的保护效果，推荐浓度均为最高的MIC值。为减少防腐剂的剂量和避免微生物的耐受性，可根据防腐剂的性质混合使用。在推荐浓度下，酶的活性一般不会受到影响。不过，实际的用量需要根据实验结果来确认。
微生物种类：
细菌I：
枯草芽孢杆菌，大肠杆菌，铜绿假单胞菌，金黄色葡萄球菌，粪链球菌 ； 细菌II：
气单孢菌，甲基对硫磷降解菌，黄杆菌属，普通变形杆菌，铜绿假单胞菌，荧光假单胞菌， 恶臭假单胞菌； 酵母/真菌：
白色念珠菌，深红酵母，稻属曲霉菌，总状毛霉，常现青霉。
理想的防腐剂应该具备以下性能 ：
不含汞
无致癌或致突变成份
广谱的抑菌效果
混合使用扩大抑菌范围
低 MIC值
无或极低的微生物耐受性，特别是使用混合防腐剂时
无或极少的检测干扰
易溶于水（推荐浓度下）
毒性比叠氮钠低，在推荐浓度下无毒性
高度稳定，效用时间长
无色，无味
适用于液体试剂
5－Bromo-5-nitro-1,3-dioxane (BND) 推荐浓度： 低污染风险及低蛋白浓度（＜ 0.2%）：0.2 mg/mL; 高污染风险及高蛋白和底物浓度： 0.4 mg/mL。 最适pH： 5.0-7.0 稳定性：pH ＜ 5 及温度 > 50度时不稳定，有腐蚀性 结合本人工作，很多情况下只添加ProClin 300 效果不是很好，BND（0.2g/L）和ProClin 300 (1g/L)是一个不错的搭配选择。至于最适PH值，本人亲测过在PH值为5.0、6.0、7.4时（不同的发光项目），该搭配24个月的防腐效果没有问题。当然没有放之四海而皆准的搭配，具体的情况需要具体分析。 混合使用： 能和多种防腐剂混合使用，如MIT、HPO 杀死细菌的作用比较缓慢，需要较长的时间来达到最佳的抑菌效果 。 CAA又叫2-氯乙酰氨，白色粉末，结合本人工作，目前主要用在磁珠稀释液中（1g/L）搭配ProClin 300 (1g/L)效果还不错。需要说明的是本人用的是链霉亲和素磁珠，稀释液中蛋白浓度相对比较低，如果是直接将抗体偶联至磁珠上，稀释液中多半需要添加高浓度蛋白（白蛋白、阻断剂等），需要进一步验证该搭配的有效性。 2-Methyl-4-isothiazolin-3-one hydrochlorid 混合使用： 能和所有防腐剂混合使用。如和有效抑制真菌的防腐剂（如BND、HPO）一起使用，可以大大拓宽抗菌谱 作用位点： 被认为是所有蛋白上的－NH2和－SH基团 毒性： 推荐浓度下无毒性。无致癌和致突变 推荐浓度：低污染风险及低蛋白浓度 最适pH： 4.0-7.0 稳定性：pH >8.5和温度>50度时稳定性下降。可短时间加热至超过100度，活性不受影响 2-Methyl-4-isothiazolin-3-one hydrochlorid, CAS：26172-54-3，中文名为2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮盐酸盐，白色粉末，结合本人工作，在很多项目稀释液中用了2-Methyl-4-isothiazolin-3-one hydrochlorid（0.4g/L）和BND（0.2g/L）的搭配，目前看来效果还是不错的。此外罗氏诊断的电化学发光试剂中绝大部分项目都使用此防腐剂，有兴趣的可以尝试。 抗菌性能： 对真菌和酵母的作用比较温和，建议与其他防腐剂混合使用 混合使用： 能和所有不分解甲醛的防腐剂混合使用，特别是BND、MIT和HPO 作用位点： 作用于细胞蛋白的-COOH、-NH2、-OH和-SH 基团 毒性： 在使用浓度下无毒性 推荐浓度：>2.6 mg/mL 兼容性： 可和离子型、非离子型表面活性剂及蛋白一起使用 Imidazolidinylurea,中文名： 咪唑烷基脲，白色粉末，本人目前工作中没有用过该防腐剂，通过查阅文献可知体外诊断试剂通常使用0.2%工作浓度的 Imidazolidinyl urea 作为防腐剂。2-Hydroxypyridine-N-oxide, pure 2-Hydroxypyridine-N-oxide,中文名： 2-羟基吡啶N-氧化物，该物质严格说不算是防腐剂，其作用跟EDTA或EGTA等常用金属离子螯合剂（Ca+）类似，可以与重金属生成螯合物，很多蛋白酶发挥作用依赖于金属离子，相当于间接的抑制了试剂中蛋白酶的活性进而提高了试剂的稳定性。罗氏诊断的电化学发光试剂中绝大部分项目都添加有该物质，有兴趣的可以尝试。 除了上述介绍的防腐剂之外，还有一些其他常用的防腐剂， 曾经是体外诊断试剂中常用的防腐剂之一，可抑制细菌生长，溶于水、液氨，不溶于乙醚，微溶于乙醇，用量一般为0.1%~0.5%。多数情况下行之有效，但由于其含有氨基，会干扰辣根过氧化物酶（HRP）、超氧化物歧化酶、触酶等多种酶，所以一般含有HRP的试剂都不建议使用。同理，一般不用于抗体及酶免实验中的标本保存。另外，它能阻断细胞的电子传递链，对许多生物体都有毒性，因此也不适用于活体实验。同时，叠氮钠与氰化物相似，属于剧毒化合物，半数致死量为27mg/kg（大鼠，经口），对细胞色素氧化酶和其他酶有抑制的作用，并能使体内氧合血红蛋白形成受阻，有显著的降压作用。急性中毒出现头晕、头痛、全身无力、血压下降、心动过缓和昏迷。除对眼和皮肤有刺激性外，还可经吸入、口服或皮肤吸收引起中毒死亡，而且遇高热或剧烈震动能强烈爆炸，使用时应十分注意安全。出于安全方面的考虑，叠氮钠的使用日益受限。在日常使用中，会碰到购买、运输、存储、使用等种种限制。 ProC lin 300 主要活性成分是两种异噻唑啉酮的混合物，包含甲基氯异噻唑啉酮（5-Chloro-2-methyl-4-isothiazolin-3-one, CMIT）和甲基异噻唑啉酮（2-Methyl-4-isothiazolin-3-one, MIT），含量比例为3:1，产品组成中含有稳定剂（烷基羧酸稳定剂 Alkyl carboxylate）和溶剂（改性丙二醇 Modifiedglycol）。适用于PH范围：2-8.5。目前市场使用比较多的是西格玛ProClin300、牛莎ProClin300 。ProC lin 950 抑菌剂是一种高效的抑制微生物生长的抑菌剂，专用于 IVD，包含用于各种试剂、 质控品、校准品、缓冲液、离子选择电极（ISE）、胶体金法（GIA）、酶免疫（EIA）、血细胞保存、血型检验试剂和层析中的流动相。由于具有广泛的抑制微生物生长的效果、极佳的相容性和稳定性、低毒并可生物降解使 ProC lin 950 抑菌剂成为一种理想的，可替代硫柳汞（含汞有机物）、叠氮钠（易燃易爆 剧毒品）、庆大霉素（抗生素原料药）等传统抑菌剂的新型抑菌产品。ProC lin 950 抑菌剂可抑制细菌、 真菌、酵母菌的生长，从而使体外诊断产品具有更好的有效期和开瓶有效期， 良好的水溶性帮助在体外诊断试剂产品中的广泛应用。尤其值得一提的是， ProC lin 950 抑菌剂不影响大多数体外诊断产品中酶的活性，也不影响反应体系中抗原抗体的结合，也不影响反应中指示物吸光度的变化。好了，关于防腐剂就说到这里吧，有什么错误的地方还请广大同行专家指正。
编辑：Jason | 校对：Harris | 责编：Hillson
公司简介
德国维润赛润（Institut VirionSerion GmbH）成立于1978年，是国际知名的诊断产业原料生产商和供应商。公司的研发和生产基地位于德国维尔茨堡，已通过DIN EN ISO 13485质量体系认证，拥有三级生物安全实验室(P3实验室)。经过了40余年的发展，公司构建了丰富的生物原料产品线，主要包括天然抗原、重组抗原、人源化单克隆抗体和磁珠等。
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