经验分享:谈谈IVD中的防腐剂

添加时间:2022年7月1日

经验分享:谈谈IVD中的防腐剂

  • 德国维润赛润CACLP展位号:B5-0805
为提高诊断试剂盒的稳定性,在生产过程中通常需要加入防腐剂。这些试剂的质量将会影响成品试剂盒的性能。
诊断试剂盒中的组分,比如试剂和标准品,均可被微生物分解,因此容易受到微生物的污染。为了提高试剂盒的存储稳定性,在生产过程中必须添加防腐剂。然而,要找到适合诊断试剂盒生产所需的防腐剂是件非常困难的事情。因为该防腐剂除了有效的抗细菌、酵母和真菌的性能外,还必须不能影响试剂盒中各组分的活性。防腐剂会使酶、抗体、抗原等蛋白类物质变性或破坏其免疫结构。另外,防腐剂还会造成竞争性抑制,例如抑制酶和底物的结合、抗体和抗原的结合等。因此,在诊断试剂盒的开发过程中,选择合适的防腐剂是非常重要的一个步骤。
 
应用
防腐剂在诊断试剂盒中用作保护剂。为获得最佳的保护效果,推荐浓度均为最高的MIC值。为减少防腐剂的剂量和避免微生物的耐受性,可根据防腐剂的性质混合使用。在推荐浓度下,酶的活性一般不会受到影响。不过,实际的用量需要根据实验结果来确认。
 

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微生物种类:

 

细菌I:

枯草芽孢杆菌,大肠杆菌,铜绿假单胞菌,金黄色葡萄球菌,粪链球菌 ;

细菌II:

气单孢菌,甲基对硫磷降解菌,黄杆菌属,普通变形杆菌,铜绿假单胞菌,荧光假单胞菌, 恶臭假单胞菌;
 

酵母/真菌:

白色念珠菌,深红酵母,稻属曲霉菌,总状毛霉,常现青霉。
 

经验分享:谈谈IVD中的防腐剂

理想的防腐剂应该具备以下性能

 

  • 不含汞 

  • 无致癌或致突变成份 

  • 广谱的抑菌效果 

  • 混合使用扩大抑菌范围 

  • 低 MIC值 

  • 无或极低的微生物耐受性,特别是使用混合防腐剂时 

  • 无或极少的检测干扰

  • 易溶于水(推荐浓度下) 

  • 毒性比叠氮钠低,在推荐浓度下无毒性

  • 高度稳定,效用时间长

  • 无色,无味 

  • 适用于液体试剂

下面我们来介绍一下常见的几种防腐剂
 
5-Bromo-5-nitro-1,3-dioxane (BND)
 
抗菌性能:有效抑制细菌、酵母和真菌 
混合使用:能和多种防腐剂混合使用 
作用位点:被认为是氧化必需酶中的巯基 
干扰:受半胱氨酸干扰,还原剂将降低抗菌效果 
毒性:推荐浓度下无毒性。不致癌和致突变 
推荐浓度:低污染风险及低蛋白浓度(< 0.2%):0.2 mg/mL; 高污染风险及高蛋白和底物浓度:0.4 mg/mL。
最适pH:5.0-7.0 稳定性:pH < 5 及温度 > 50度时不稳定,有腐蚀性 
兼容性:可和蛋白、非离子型表面活性剂一起使用 
 
结合本人工作,很多情况下只添加ProClin 300效果不是很好,BND(0.2g/L)和ProClin 300 (1g/L)是一个不错的搭配选择。至于最适PH值,本人亲测过在PH值为5.0、6.0、7.4时(不同的发光项目),该搭配24个月的防腐效果没有问题。当然没有放之四海而皆准的搭配,具体的情况需要具体分析。
 
2- Chloroacetamide (CAA)
 
抗菌性能:高效抑制酵母,有效抑制细菌和真菌 
混合使用:能和多种防腐剂混合使用,如MIT、HPO
毒性:推荐浓度下无毒性。无致癌和致突变 
推荐浓度:≥ 2.6 mg/mL
最适pH:4.0-8.0 
稳定性:在大多数情况下均稳定 
兼容性:可和离子型、非离子型表面活性剂一起使用 
杀死细菌的作用比较缓慢,需要较长的时间来达到最佳的抑菌效果 。
 
CAA又叫2-氯乙酰氨,白色粉末,结合本人工作,目前主要用在磁珠稀释液中(1g/L)搭配ProClin 300 (1g/L)效果还不错。需要说明的是本人用的是链霉亲和素磁珠,稀释液中蛋白浓度相对比较低,如果是直接将抗体偶联至磁珠上,稀释液中多半需要添加高浓度蛋白(白蛋白、阻断剂等),需要进一步验证该搭配的有效性。
 
2-Methyl-4-isothiazolin-3-one hydrochlorid
 
抗菌性能:高效抑制细菌,酵母和真菌 
混合使用:能和所有防腐剂混合使用。如和有效抑制真菌的防腐剂(如BND、HPO)一起使用,可以大大拓宽抗菌谱
作用位点:被认为是所有蛋白上的-NH2和-SH基团 
干扰:可能胺类和硫化物对其有干扰 
毒性:推荐浓度下无毒性。无致癌和致突变 推荐浓度:低污染风险及低蛋白浓度
最适pH:4.0-7.0 稳定性:pH >8.5和温度>50度时稳定性下降。可短时间加热至超过100度,活性不受影响 
兼容性:可和离子型、非离子型表面活性剂一起使用
缺点:价格偏高
 
2-Methyl-4-isothiazolin-3-one hydrochlorid, CAS:26172-54-3,中文名为2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮盐酸盐,白色粉末,结合本人工作,在很多项目稀释液中用了2-Methyl-4-isothiazolin-3-one hydrochlorid(0.4g/L)和BND(0.2g/L)的搭配,目前看来效果还是不错的。此外罗氏诊断的电化学发光试剂中绝大部分项目都使用此防腐剂,有兴趣的可以尝试。
 
Imidazolidinylurea (IZU)
 
抗菌性能:对真菌和酵母的作用比较温和,建议与其他防腐剂混合使用 
混合使用:能和所有不分解甲醛的防腐剂混合使用,特别是BND、MIT和HPO
作用位点:作用于细胞蛋白的-COOH、-NH2、-OH和-SH 基团 
毒性:在使用浓度下无毒性 推荐浓度:>2.6 mg/mL
最适pH:4.5-8.5
兼容性:可和离子型、非离子型表面活性剂及蛋白一起使用
Imidazolidinylurea,中文名:咪唑烷基脲,白色粉末,本人目前工作中没有用过该防腐剂,通过查阅文献可知体外诊断试剂通常使用0.2%工作浓度的Imidazolidinylurea 作为防腐剂。
 
2-Hydroxypyridine-N-oxide, pure
抗菌性能:广谱 
混合使用:能和其他防腐剂混合使用 
作用机理:和重金属生成鳌合物 
毒性:在使用浓度下无毒性 
推荐浓度:1.3 mg/mL
最适pH:5.0-8.0
2-Hydroxypyridine-N-oxide,中文名:2-羟基吡啶N-氧化物,该物质严格说不算是防腐剂,其作用跟EDTA或EGTA等常用金属离子螯合剂(Ca+)类似,可以与重金属生成螯合物,很多蛋白酶发挥作用依赖于金属离子,相当于间接的抑制了试剂中蛋白酶的活性进而提高了试剂的稳定性。罗氏诊断的电化学发光试剂中绝大部分项目都添加有该物质,有兴趣的可以尝试。
 
除了上述介绍的防腐剂之外,还有一些其他常用的防腐剂,
 
叠氮钠:
曾经是体外诊断试剂中常用的防腐剂之一,可抑制细菌生长,溶于水、液氨,不溶于乙醚,微溶于乙醇,用量一般为0.1%~0.5%。多数情况下行之有效,但由于其含有氨基,会干扰辣根过氧化物酶(HRP)、超氧化物歧化酶、触酶等多种酶,所以一般含有HRP的试剂都不建议使用。同理,一般不用于抗体及酶免实验中的标本保存。另外,它能阻断细胞的电子传递链,对许多生物体都有毒性,因此也不适用于活体实验。同时,叠氮钠与氰化物相似,属于剧毒化合物,半数致死量为27mg/kg(大鼠,经口),对细胞色素氧化酶和其他酶有抑制的作用,并能使体内氧合血红蛋白形成受阻,有显著的降压作用。急性中毒出现头晕、头痛、全身无力、血压下降、心动过缓和昏迷。除对眼和皮肤有刺激性外,还可经吸入、口服或皮肤吸收引起中毒死亡,而且遇高热或剧烈震动能强烈爆炸,使用时应十分注意安全。出于安全方面的考虑,叠氮钠的使用日益受限。在日常使用中,会碰到购买、运输、存储、使用等种种限制。
 
ProClin 300:
ProClin 300 主要活性成分是两种异噻唑啉酮的混合物,包含甲基氯异噻唑啉酮(5-Chloro-2-methyl-4-isothiazolin-3-one, CMIT)和甲基异噻唑啉酮(2-Methyl-4-isothiazolin-3-one, MIT),含量比例为3:1,产品组成中含有稳定剂(烷基羧酸稳定剂 Alkyl carboxylate)和溶剂(改性丙二醇 Modifiedglycol)。适用于PH范围:2-8.5。目前市场使用比较多的是西格玛ProClin300、牛莎ProClin300
 
ProClin 950 
ProClin 950 抑菌剂是一种高效的抑制微生物生长的抑菌剂,专用于 IVD,包含用于各种试剂、 质控品、校准品、缓冲液、离子选择电极(ISE)、胶体金法(GIA)、酶免疫(EIA)、血细胞保存、血型检验试剂和层析中的流动相。由于具有广泛的抑制微生物生长的效果、极佳的相容性和稳定性、低毒并可生物降解使 ProClin 950 抑菌剂成为一种理想的,可替代硫柳汞(含汞有机物)、叠氮钠(易燃易爆 剧毒品)、庆大霉素(抗生素原料药)等传统抑菌剂的新型抑菌产品。ProClin 950抑菌剂可抑制细菌、 真菌、酵母菌的生长,从而使体外诊断产品具有更好的有效期和开瓶有效期, 良好的水溶性帮助在体外诊断试剂产品中的广泛应用。尤其值得一提的是, ProClin 950 抑菌剂不影响大多数体外诊断产品中酶的活性,也不影响反应体系中抗原抗体的结合,也不影响反应中指示物吸光度的变化。
 
好了,关于防腐剂就说到这里吧,有什么错误的地方还请广大同行专家指正。
 
来源:IVD工作者 IVDer

 

编辑:Jason | 校对:Harris | 责编:Hillson

 
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公司简介

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德国维润赛润(Institut VirionSerion GmbH)成立于1978年,是国际知名的诊断产业原料生产商和供应商。公司的研发和生产基地位于德国维尔茨堡,已通过DIN EN ISO 13485质量体系认证,拥有三级生物安全实验室(P3实验室)。经过了40余年的发展,公司构建了丰富的生物原料产品线,主要包括天然抗原、重组抗原、人源化单克隆抗体和磁珠等。

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