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德国维润赛润CACLP展位号：B5-0805
试剂开发是一项浩大的系统工程，一路上的磕磕绊绊在所难免。在本系列推文中，HyTest应用实验室的技术平台负责人将带大家分别从化学发光和侧向层析两大平台出发，对那些常见的亦或是不常见的问题进行梳理。
希望相关内容能对研发的小伙伴们有所帮助或启发。同时，大家如有疑问和建议，也欢迎在文章下方留言与我们互动。
那么，接下来就从第一期化学发光背景值的话题开始，开启我们的旅程吧~
目前中国市场主流的化学发光产品，从其发光原理区分，主要有电化学发光（三联吡啶钌）、直接化学发光（吖啶酯）和间接化学发光，又称酶促化学发光（辣根过氧化物酶HRP和碱性磷酸酶ALP）。
先说吖啶酯系统，吖啶酯的核心结构如图1所示，R和X可以是多种合适的基团，目前中国市场上主流的吖啶酯衍生物是NSP-DMAE-NHS (CAS NO. 194357-64-7)和NSP-SA-NHS (CAS NO. 199293-83-9)。有条件的厂家会做一些定制化的吖啶酯衍生物，旨在提高吖啶酯本身的亲水性能，稳定性和量子产率（quantum yields）。
图1 吖啶酯衍生物
分析吖啶酯系统背景（0值）发光结果异常升高的原因，首先需要定位是在整个实验过程的哪一步异常，导致背景升高。
一般的全自动化学发光系统有以下步骤（以双抗体夹心法为例），见图2
图2 全自动化学发光系统的简易流程
在某些情况下，厂家生产、运输及保存的反应杯，会有概率发生静电积累的现象。大多数厂家的吖啶酯检测系统，在读数模块工作前，会先在反应杯中注入激发液B（通常是特定浓度的氢氧化钠溶液），然后读数模块立刻进行读数操作。在这个激发液的注入过程中，可能会使反应杯中积累的静电释放，并被光电倍增管捕捉到，从而导致背景异常升高。
此情况多发生在研发阶段，通常外购的吖啶酯是粉末状态，在配制吖啶酯稀释液的过程中，会有少量的吖啶酯消散在环境中，成为了实验室气溶胶的一部分，如果吖啶酯气溶胶含量达到一定程度，会污染敞口放置的反应杯，或是敞口放置的洗涤液桶。吖啶酯在只有1 pmol/L的浓度下，依然有很高的发光值，远高于背景值，图3所示。所以研发过程中，吖啶酯引起的污染也需要重视。
（左图是正常背景；右图是含有1pmol/L浓度的吖啶酯信号）
导致背景异常升高
目前市场上在售的吖啶酯，都是经过琥珀酰亚胺酯（–NHS ester）修饰的，它的存在使得吖啶酯可以直接和伯胺（–NH2）反应，形成稳定的酰胺键。伯胺普遍存在于多肽链的 N-端和赖氨酸氨基酸残基的侧链中。所以修饰过的吖啶酯很容易在水性介质中与蛋白质（例如抗体）发生反应。通常吖啶酯偶联工艺，投料的吖啶酯摩尔量是超过抗体的，这些过量的吖啶酯需要进行终止，此时可添加Tris、甘氨酸或赖氨酸缓冲液以淬灭反应。未经过充分淬灭的吖啶酯抗体偶联物，可能会导致背景的异常升高。
有条件的话，可以在偶联工艺最后中加入一步纯化操作，G50和G25脱盐柱都是很好的选择。有些抗体在与吖啶酯偶联后，会发生少量的聚集现象，形成超过抗体本身大小的聚集形态，在溶液中无法很好的分散，这也会导致背景异常升高。此时G50和G25无法纯化这些形态的抗体，推荐使用更高分辨率的Superdex 200柱或其它替代品进行分离纯化。
也会引起的背景异常升高
偶联有吖啶酯的抗体和包被有抗体的磁珠，在不同厂家自己的化学发光系统中进行免疫反应时，磁珠可能会发生异常聚集，该现象会导致检测结果的异常。全自动检测发光仪多数是全封闭系统，在反应杯中发生的磁珠聚集很难发现，所以很多研发人员会忽略这个情况，此时可能需要优化整个反应体系。其中，磁珠的种类，pH值和盐浓度等都是可选的优化方向。
（左边反应杯中的磁微粒为均一的悬浊液；右边反应杯中的磁微粒发生了肉眼可见的聚集现象）
各个厂家开发的化学发光检测系统，都会有一个正常背景信号值的基线或标准。如果在试剂的开发或检测过程中，发现某些项目的背景信号值高出厂家设定的基线很多倍，在排除上述所有的可能性后依然没有解决，也可以尝试从原辅料搭配选择适配性等方面寻找原因。表面活性剂、生物基质原料例如BSA、酪蛋白和动物血清等辅料的选择、搭配以及批次差异均是需要加以考量的因素。
在试剂开发过程中，遇到部分性能异常或不及预期，研发人员通常优先想到的是抗体问题，所有的性能偏差都会归因于抗体性能的问题。其实，抗体的适配性问题常常被研发人员忽视，不同的标记物标记相同抗体的表观性能也会在部分项目中存在较大差异。上文中提及的吖啶酯和碱性磷酸酶，是目前化学发光平台最主要的标记物，两者在在分子量和分子结构上也存在巨大的差异。作为小分子的吖啶酯与抗体偶联后，偶联物本身一般不会增加空间位阻。而市场上常用的重组碱性磷酸酶，分子量约为124KD，与抗体偶联后会增加反应的空间位阻，两种抗体偶联物的检测结果可能就会存在一定的差异。综上，抗体的适配性是一个系统问题，需要我们综合评估。
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