很多同学在用胶体金标记抗体的时候,可能一次性用不完,就会4℃放一晚上甚至更长时间,等再用的时候就会发现,胶体金竟然大部分都沉淀下来了。
为什么我标记的时候感觉挺好的呀,没感觉有沉淀的迹象啊。
我曾经也遇到过这样的问题,尤其是大批量生产的时候,这个现象可能你会察觉的更明显。
水中的颗粒之所以会沉淀,那肯定是粒径变得很大,密度大于水以后才会发生。为什么粒径变大了呢?肯定跟你的整个标记或者保存过程有关系,因为胶体金本身是不会沉淀的。
对于胶体金来说,抗体的加入本来是可以增加它的稳定性的,但是不当的加入反而会加速它的聚沉。抗体的加入不当,无非也就是抗体标记pH不合适,或者蛋白的加入量不足。
1)我们在用胶体金标记抗体的时候,如果pH偏低或者卡在临界值附近,抗体整体带正电,胶体金带负电,网状交联就悄悄地产生了,可能开始不明显,但这是可以慢慢累积的一个非常不利的因素;
2)还有就是蛋白标记量不足,狼多肉少的竞争关系,必然会使得颗粒与抗体的共用,也是可以产生交联的。
很多同学说,我事先都摸索好了小样的最佳标记条件了,到了大样就又不行了,其实这正是问题的所在。过度细致地摸索标记的最佳临界值,不预留空间,放大生产会出现很大的问题。
有些颗粒变大的过程是可以出现在封闭这个环节的。常用的封闭剂就是BSA,我不知道大家对BSA有没有一个认知,就是不同厂家的BSA有时候做出来的结果可能是天差地别。每个厂家可能是由于纯化工艺有区别,里面的盐离子,杂蛋白含量均有差异,所以实验结果有差异。我们不能说贵的就好,便宜的就差,反正封闭环节所用的BSA也是必须要针对性考察的一个因素。
这个算是直接影响标记产物的一个因素了吧。考察它,无非就是考察它的理化环境和成分。首先,pH是首先要考察的最重要的因素。其实不管是标记过程还是标记产物,它们基本上都是喜碱不喜酸,归根到底还是抗体本身的带电情况决定的。然后就要考虑里面的其他成本,比如这里又出现了BSA,或者是蔗糖,我们可以逐一排除。
说到这里,有的同学想问,我怎么知道究竟是哪个因素引发的我的颗粒变大的呢?其实您可以并行做实验验证一下,看看哪个因素影响最大。
比如取3支管做平行实验,一个仅仅加入抗体后为止;一个做到封闭完成为止;一个完成整个过程为止;3支管同时4℃过夜,看看沉淀出现在哪个环节。
最后插一句,离心条件对聚沉有影响吗?大家可以思考一下。
编辑:Jason | 校对:Harris | 责编:Hillson
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