免疫反应中通常包含以下反应模式：双抗体夹心法、间接法、捕获法、竞争法。（双抗原夹心之前讲过一期，这里不做赘述）
双抗体夹心一般用于检测分子量较大的、抗原表位至少2个以上的标志物，一般分为一步法和两步法。
一步法：固相抗体、样本、指示抗体3种成分同时混在一起反应；
两步法：固相抗体先与样本反应，经过清洗步骤再与指示抗体反应。
讨论：一步法有反应时间短的优势，但是这种反应模式抵抗干扰物质的能力较弱，并且很容易产生HOOK。比如常见的HCG检测，对于临床上遇到的检测数值高于百万mIU/mL的一些样本，有时候试剂的反馈结果可能也就几千甚至几百的数值，使用两步法至少不会让该检测值低于试剂的线性高值。
另外说一下对于一些含有较多相同表位的抗原，比如病毒的S蛋白，采用双抗夹心的方法检测，我们通常会遇到微球交联聚集的问题，对此公众号IVD工具人的创建者纪总帮我们提供了西门子的Atellica® VTLi的一种解决思路：固相抗体标记链霉亲和素，原来用作标记微球的抗体进行部分生物素化处理，作为游离抗体的形式与样本进行反应。这里最关键的字眼就是“部分生物素化”，因为生物素化过多，交联依旧不可避免；生物素化过少，则反应灵敏度又要受影响，因此该工序无疑是整个反应体系的关键工序。
并且有一种反应模式，算是一步法的变体，首先是将指示抗体与样本反应，未经清洗（当然了，也没法进行清洗），然后再混入固相抗体进行反应。这么做的优势是什么呢？相比于上述的一步法，这么做可以一定程度的提升灵敏度。比如我们筛到了一个好的指示抗体，但是它与被检测物质的亲和力没有固相抗体强，或者说它与被检测物质的反应受固相抗体的一些影响，这时候我们优先让其与被检测物进行反应，采用笨鸟先飞的方式，灵敏度会更符合预期。
为什么我要将这两种方法放在一起呢？接下来咱们一起来看一下：
间接法一般用于抗体检测，尤其是含量较丰富的IgG类型抗体的检测。通常做法是固相载体偶联抗原，指示抗体采用带有指示剂的抗IgG的二抗，比如用来检测血清中的病毒抗体、自身抗体等。
捕获法同样用于抗体检测，但是通常用于检测含量较低的除IgG以外的其他类型的抗体，比如IgA、IgM、IgD、IgE。通常做法是固相载体偶联抗某一类型的二抗，指示剂则用来标记相对应的抗原。
为什么IgG检测推荐间接法，而其余类型的抗体检测推荐捕获法呢？我们先来看一下各类型抗体在人血清中的正常参考区间：
由于IgG在人体血清中处于绝对优势，所以如果采用间接法检测其余类型的抗体，IgG势必会参与固相包被抗原的竞争，对于IgA和IgM还好说，对于IgD和IgE，那简直不是一个数量级。所以一些采用间接法检测IgM的厂家，通常会往样本稀释液或合适的位置添加IgG吸附剂；而对于IgE类型的检测，直接舍弃间接法而采用捕获法。说到IgE抗体的检测，咱们展开说一下目前过敏原检测的联检问题。对于过敏原的多项联检问题，不管是用编码磁珠的流式平台也好，还是微阵列蛋白芯片也好，目前还是逃脱不了间接法，因为间接法是实现多项联检的前提，目前流式细胞仪还达不到给每个检测项目单独配置一个检测通道的条件，所以样本前处理过程，如何能保证IgE不受其他类型抗体的干扰是一个十分棘手的问题。
另外咱们说一下免疫层析和其他方法学在这两种检测模式的区别。免疫层析不管是什么检测模式，都是一步法检测，不存在清洗步骤；而Elisa和发光等方法，中间都会存在清洗过程，所以有时候在免疫层析平台，你可能分不清你做的究竟是间接法还是捕获法，我举个例子：比如对于新冠IgG和IgM抗体的检测，在发光平台，如果你采用捕获法，一般是样本中的IgG和IgM先和固相抗体反应，经过清洗，然后再和指示抗原反应，这是传统意义的捕获法步骤；但是在免疫层析平台，指示抗原先和IgG和IgM反应，然后该复合物去和NC膜的固相抗体反应，整个反应过程是相反的，按我的理解应该算是一个变相的捕获法，优点就是可以做到IgG和IgM联检。
这里我再引申一个基于间接法检测IgG/IgM抗体的项目——CCP。由于CCP是多肽，所以一般会借助链霉亲和素磁珠和生物素化的CCP来进行CCP的偶联，如果您把链霉亲和素磁珠、Biotin-CCP当作试剂盒的两个组分来做，一定要注意样本中的生物素的干扰问题，目前维生素的泛滥使得一些人血清中生物素类似物含量很高，这很容易导致结果的假阴性。
一般用来检测小分子，反应位点只有1个，Elisa或者化学发光通常是将抗体包被在固相载体，然后采用指示抗原去检测。对于免疫层析法则正好相反，一般是将偶联有载体蛋白的小分子抗原包被在NC膜，然后用胶体金等颗粒标记抗体，有人问我可不可以调换个顺序？不建议，因为让样本先与抗体接触肯定是灵敏度最高的做法。
竞争法的关键工序一般出现在小分子的偶联、样本的前处理、抗体与抗原的量的匹配，因此相对于双抗夹心法，竞争法的工艺相对难搞一些，所以目前陆续出现了小分子的夹心检测方式，A抗体用来捕获小分子，B抗体用来捕获（小分子-A抗体）复合物，这样的做法让生产工艺变得更加简单。
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