讲这个问题之前,首先问大家一个问题,为什么微流控成本这么高,大家还不遗余力地去做探索?答案就在这个“控”字上。对于免疫层析,样本爬样有点太随意了,完全处于一个不受控的状态,爬样状态和结果就像掷骰子,即使我们把能做的功课都做足了,也难免有个别的样本跟你调皮一下,非得不按套路出牌。虽然这个概率可能不到1%,但是从产品每年的出货量考虑,比如出货量是20万人份/年,不合格条数就是2000条,这2000条不知道会招来多少个投诉。微流控分为被动微流控和主动微流控,被动微流控一般都是仅靠虹吸去爬样,做到相对可控;主动微流控则会加上传感器,根据压力去控制流样完全可控。当初这个概念刚出来的时候,我就觉得这确实是掀桌子的一个壮举,但是奈何成本高出普通的膜垫层析太多,并不适合大众普及。
再讲一个问题,问一下做过层析的同学,层析产品是定性好做,还是定量好做,或者是半定量好做?前些天有人说,好做顺序:定量产品>定性>半定量。从我个人而言,我没法给出结论,只能说各有难点。定性产品哪里难?特异性!阴性样本不允许出现一丝丝的条带;半定量产品哪里难?不仅仅不让出假阳,还得严格地卡住半定量的那几个点的条带深浅;定量产品哪里难?cv不好把控,跟发光产品比,可能就是个学渣级别的,但是阴性样本允许存在一定的背景条带,因为软件可以扣除,讲到这里,我大概明白那个朋友做这个排序的依据了,他肯定是做定性产品做多了😁!
上面我们说到了,和微流控的精装修相比,膜垫搭配的层析就像个毛坯房,样品垫+结合垫+nc膜+吸水纸,永恒不变的几大版块。那么层析这么大的cv,到底能不能控一下呢?在哪里控呢?
和微球直接接触的就是结合垫,它的类别直接影响了微球的释放状态。它的种类实在太多了,目前最主流的就是玻纤和聚酯,但是我们似乎并不在乎它是什么材质,好用就行。从我个人的角度,我喜欢将它们分类成以下几个方面:
A常见的玻纤。像是奥斯龙的8964,表面上丝丝缕缕的,亲水性特别好,蓄水量也特别足,释放速度快,残留少,是很多人非常喜欢的一款玻纤。但是,我个人觉得,对于很多新手,可能觉得它并不好用,因为它对于CV方面的把控并不是特别好,因为材质表面的丝丝缕缕,让很多人做出来的试纸条Stream都非常严重,跑出来的线条也是丝丝缕缕,深深浅浅,CV自然也就大了。
B常见的聚酯。聚酯的种类非常多,有像打印纸一样致密的,也有像奶酪的表面一样坑坑洼洼的。它们的特点就是亲水性普遍都很好,释放很柔和也很彻底,整体的cv把控要比常见的玻纤要好一些,虽然成本高一些,但更适合新手拿来做定量产品。
C疏水性材质。很多人做时间分辨也好,上转发光也罢,微球的释放对他们来说总是个大问题。我用过很多公司的产品,发现很多产品层析完了,结合垫还像没层析过一样,残留的不像话。这种就适合用偏疏水一些的材质,释放速度很快,释放残留非常低,唯一的缺点就是得事先处理才能用。通常情况,疏水的垫子,cv把控中规中矩,喷金量偏大一些,相对能把控的很好。
D结合垫/样品垫一体材质。目前国外的一些厂家生产出了pet材质的一体垫,既具备玻纤亲水性极佳的特点,又具备聚酯释放均匀柔和的特点,可以说是把优点集中到一起了吧,而且用一个垫子,比用两个垫子引入的变异肯定更小。不过,它们材质普遍偏厚一些。
2、喷金or铺金?烘干or冻干?
这个方面大家应该一目了然,从工序出现的时间先后就可以推断哪种更好。铺金的出现都是之前做胶体金定性产品的时候,那时候大部分厂家都还是采用无纺布的年代,如果采用铺金的工艺来做定量产品,并不是说不行,只不过和喷金相比,确实CV更难把控,因为铺金的均匀度和干燥过程中的动态变化是比较难以把控的。再说一下烘干和冻干,因为目前荧光颗粒的粒径都在200nm以上,烘干其实很容易引发颗粒的聚集或者严重的边缘效应,冻干在保持蛋白活性和疏松程度方面都能很好把控,所以冻干毋庸置疑是优于烘干的。所以综上来看,如果喷金配合冻干,理论上是最优的选择。但是厂家还得考虑成本问题,在很多方面不得不做出取舍。
微球的标记我不想再谈了,我只说一下为什么有时候同一批次的条子测试相近浓度的不同样本,很多时候T和C值差别非常大?我有时候会掰开卡壳观察不同样本的测试状态,发现微球都出现了不同程度的堵膜,暂且不考虑不同样本堵膜会有差异的问题,就说直接上样本稀释液就有堵膜的这种问题,能不能做出改善?对于层析产品,堵膜是一件非常糟糕的事情,不仅CV不好,还会引入非常大的偏差,准确度都成了问题。所以我们需要从各个方面考虑,如何让我们的微球分散性更好,聚合形式比例更少。比如之前美牛生物提到的,让标记缓冲盐离子浓度降到很低等。
目前为了防止类风湿因子或者异嗜性抗体的干扰,阻断剂的使用变得非常普遍,一般都是加在样品垫处理液里面。首先考虑这个阻断剂是不是鼠源的,而你的C线用的是不是羊抗鼠,这样的话本身体系就存在问题,导致C线很弱;如果样品垫处理的过程本身就不均匀,那么C线的高低起伏就显得很正常;同样地,有时候阻断剂对于T线也就是特异性反应也会有干扰,不同的样本干扰程度还不一样,这又导致了T线的不稳定。所以从这方面考虑,阻断剂的种类筛选和使用方法就成了很有必要的一项工作。
灵敏度不够的时候,迫不得已采用的下策。我们知道,血清样本什么状态的都有,有的像清水,有的像豆油,还有溶血的像茶色的花生油。直接上样,有的爬速正常,有的根本爬不动,CV偏大也就是家常便饭了。还有的厂家测试指尖血,暂且不提红细胞压积的差异,我感觉做指尖血的定性对我来说就挺难的,做定量?我都不想谈CV这个词了。不过,不管测全血还是血清,直接上样的话,滤血膜的使用都是必不可少的,它还多少能给试剂带来一些正向作用。那么,如果测试的是血浆,不同的抗凝剂带来的干扰,会不会引发大的变异,也得需要做严格的验证。如果没做验证,那就尽量测试血清,别整花活忽悠人。
卡壳?很多人并不在意,其实这是个加分项。加样孔的位置,结合垫处的那两个横梁的高低,是我最为在意的地方。加样孔位置偏上,会引发持续或二次层析;横梁位置靠上,卡壳便失去了意义。恰到好处的设计,能很大程度地控制层析,降低变异。
这里顺便提一下吸水纸的问题。有的吸水纸蓄水量大,但亲水性差;有的则是亲水性强,蓄水量低。选择一款合适的吸水纸,或者选取2款搭配使用,也是一个加分项。
从之前的研发经验和仪器对比来看,目前具体用哪种载体来定量已经变得没那么重要了。胶体金的仪器目前响应已足够灵敏,CV也并不输于荧光仪器。如果从颗粒的大小来考虑,胶体金(20-40nm)在灵敏度方面确实比荧光微球(200-400nm)低一些。但是,有意思的是,对于上述提到的直接上样的样本,通常胶体金跑出来的CV,反而是优于荧光微球的,它表现出的抗干扰能力更为出色,不知道是不是仅仅是出于颗粒大小的影响。
公司简介
德国维润赛润(Institut VirionSerion GmbH)成立于1978年,是国际知名的诊断产业原料生产商和供应商。公司的研发和生产基地位于德国维尔茨堡,已通过DIN EN ISO 13485质量体系认证,拥有三级生物安全实验室(P3实验室)。经过了40余年的发展,公司构建了丰富的生物原料产品线,主要包括天然抗原、重组抗原、人源化单克隆抗体和磁珠等。
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