第十九届中国国际检验医学暨输血仪器试剂博览会（CACLP）
第二届中国国际IVD 上游原材料制造暨流通供应链博览会（CISCE）
CACLP展位号：B5-0805
展会时间：2022 年3 月27 日-3 月29 日
展会地点：南昌绿地国际博览中心
02
固相载体的选择
免疫分析中的两个关键点是在一个给定的表面上捕获抗体的效率，以及需要确保捕获表面和化学试剂对比色/荧光信号测量的最小干扰。
因此，就其对免疫分析灵敏度的潜在贡献而言，固体支持物的选择是至关重要的。有多种这样的支持物可供选择。它们在化学、物理和光学特性方面彼此不同。根据它们的化学性质，可以将它们分为金属和聚合物（表2）。
聚合物固体支持物被用于微孔板、微阵列芯片或最近被广泛用于进行免疫分析的氟胶囊。
金属支撑物受到一些限制，被广泛地应用于基于生物传感器的研究和开发。然而，有来自Dixit及其同事的报告，他们采用纳米球光刻技术在各种固体支持物上生成高度有序的金表面，并证明了其在集成微流控平台和微阵列上的免疫测定开发中的潜在用途。
表2|用于免疫测定开发的各种固体支持物
2.1、用于抗体固定化和免疫测定开发的表面设计/调制和定制
2.1.1、控制表面特性的前驱体调控和制造后处理
用于免疫分析的聚合物固体支持物要么是亲水的，要么是疏水的，这主要是基于这些聚合物的单体单位的性质。
亲水聚合物通常由具有电负性功能团的单体组成。相反，疏水性单体要么缺乏任何电负性功能，要么拥有共振结构，在这种结构中，电子因有效共享而变得稳定。
各种官能团的代表，可以根据它们的亲水性来排序，即羟基>磺酸盐>羧基>氨基>磷酸酯>烷基>烯丙基>芳基。
就其化学行为而言，一个抗体有丰富的疏水袋，这些疏水袋在溶解时向其表面暴露。这些疏水区对于抗体在固体支持物上的吸附至关重要，因为抗体分子和表面之间的疏水相互作用是关键的稳定力量。
抗体也倾向于离子型、共价型和数据型的相互作用。
我们将首先讨论这些表面在化学性质方面的抗体保持能力，然后描述用于提高其蛋白质保持能力的各种方法。另外，详细了解抗体的化学性质也同样重要，因为这对于设计和优化抗体捕获的程序以及随后选择合适的表面和相关的试剂来说是决定性的。
根据表1中描述的表面分类，可以预测出抗体的容纳能力。疏水的表面有很强的产生疏水相互作用的趋势。
然而，选择一个合适的表面也取决于它的应用的性质。例如，微孔板通常由聚苯乙烯组成，它是一种疏水性聚合物，但它有各种形式，每种形式都提供不同的疏水性，并具有不同的抗体结合和保持的倾向。
很明显，聚合物固体支持物的化学性质可以通过制造条件的微小调整而发生巨大的变化。制造技术包括使用预功能化的单体单元，在聚合后会产生一个功能化的表面。
使用这种方法，只要单体单元中存在所需的功能，就可以生成具有不同功能的表面。这方面的典型例子是Nunc的表面。这些表面带有胺的功能，是通过使用胺改性的单体苯乙烯生成的。
表3总结了这一类别的相关商业产品。
表3|用于免疫测定开发的市售预功能化表面
此外，功能可以在制造过程后被嫁接到固体支持物上。有一系列制造后的表面修饰方法，用于赋予特定的表面以特定的化学性质，以提高其抗体的保持能力。
最重要的策略是嫁接小的疏水分子或以高疏水官能团为终点的分子到表面上。通过嫁接法制造聚合物基质后引入的疏水性增强了其上的抗体的钝化作用。
一些所需的功能，如胺、羧基、水杨酸等，可以在固体支持物制造后加入。
表4中总结了此类产品的清单。
与疏水聚合物不同，亲水表面具有电负性功能，大大增加了它们对水的亲和力（通过接触角测量水滴变平来衡量）。这些表面也可以按照疏水性表面所描述的相同制造方法来制造。然而，单体单元的性质或其承载的功能将根据所需的功能团的性质而改变。
表4|改善表面的亲水性和疏水性的各种方法
最初，人们认为抗体的高密度固定只能在疏水性表面实现。然而，有报告表明，与疏水表面相比，亲水表面可以容纳大量的抗体。
Vermeer及其同事对抗体的结构和功能行为进行了广泛的研究，他们的发现为后来的许多报告奠定了基础。
他们工作的一个重要结果是，与亲水表面相比，疏水表面往往能诱发抗体更高的构象变化。
这可以解释如下。
蛋白质中的疏水袋深埋在三维结构中，因此，当蛋白质在疏水表面被钝化时，预计会有很大程度的结构重组。然而，蛋白质表面存在较多的电子活性（极性、带电等）官能团，因此，当在亲水表面钝化时，不需要进行重大的结构重组。
此外，可能还有一些相关的因素，如抗体在表面吸附后的分子扁平化。这一点用傅里叶变换红外光谱（FTIR）光谱来证明。
Vermeer工作的另一个有趣的发现是，在水化水释放过程中产生的热量诱发了明显的抗体变性，这比结构重组引起的变性要大得多。这些研究结果表明，亲水表面在抗体保持能力和保存抗体活性方面更有优势。
然而，大多数市售的固体支持物（表2），如聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、环烯烃聚合物（ZeonorTM，ZeonexTM）都是疏水性的。
此外，还有各种金属表面被用于开发免疫测定；然而，这些主要限于基于生物传感器的应用。硅和金是广泛使用的金属表面，其应用范围从表面等离子体共振到基于阻抗的免疫测定。
大多数这些金属表面不能以其原始形式使用，因为其表面形成氧化层，需要激活。有各种策略可用于激活这些表面。
最常见的方法是将这些表面暴露于食人鱼蚀刻，这是一种硫酸与过氧化氢（酸性食人鱼）或氢氧化铵（碱性食人鱼）的溶液，其比例根据要求不同（3:1，7:1和12:1）。这种处理可以去除表面的氧化物，使其具有亲水性。
活化的金可以直接用于抗体捕获，但硅表面需要进一步处理。这些活化的表面可以用各种官能团嫁接，这样亲水性就可以由所使用的官能团的性质来精确控制。
金表面通常用试剂进行功能化处理，这些试剂的一端是硫醇/巯基，另一端是所需的功能团。
硫醇基团是首选，因为它们与金的结合是一步到位的。胺基也有与金表面相互作用的倾向，因为它与金有形成坐标键的倾向。
因此，胺基功能也可以被用来捕捉金表面的抗体。Pakiari和Jamshidi提出，氨基、氧和硫醇基团通过胺中的氮原子、氧（羰基）和硫醇的硫原子的配位锚以及这些官能团的氢原子与金之间的非常规氢键与金发生作用。
Dixit和他的同事采用了氨基和硫醇的硅烷功能来开发基于表面等离子体共振的免疫测定。
后一种方法对于将不同的官能团嫁接到金表面来说是快速和容易的。许多商业功能化的金表面，即胺、羧基、硝基乙酸和链霉菌素，都可以从制造商，特别是GE Healthcare那里获得。
硅表面通常用硅烷分子进行功能化，在其表面形成具有特定功能的单层。硅烷主要拥有胺基、羧基、巯基或环氧基等功能团。因此，硅表面可以首先被功能化，然后根据免疫测定的特定要求定制表面。
2.1.2、通过物理和化学方法嫁接官能团
通过采用特定的表面功能化策略，也可以实现所需的亲水性/疏水性规模。这些策略是非常稳健的，而且相对容易执行。这些策略中最重要的是聚电解质的逐层组装（LBL）。
电解质是一种拥有自由离子的物质，但多电解质是那些具有能够在溶液或凝胶相中产生自由离子的功能团的物质。当固体支持物（金属或聚合物）的表面被涂上这些聚电解质时，它们的表面特性会发生显著变化。
聚电解质介导的功能化的最常见的例子是使用聚谷氨酸和聚L-赖氨酸的LBL组装。
表5中列出了用于LBL组装的各种聚电解质系统及其在免疫测定开发领域的潜在应用。
此外，聚谷氨酸或聚L-赖氨酸的简单嫁接也可以改善基于免疫测定的应用的表面润湿性。一般来说，表面的亲水性越强，润湿性就越强，因此，在这种表面上可以实现更好的离子作用介导的固定化。
表5|用于表面功能化的市售聚电解质
用于免疫测定开发的表面有效功能化的物理和化学方法包括用硅烷进行表面活化，这些硅烷具有重要的功能，如氨基（3-氨基丙基三乙氧基硅烷（APTES））、羧基（羧基硅烷的钠盐）和环氧树脂硅烷。
然而，使用硅烷有许多相关的优点和缺点。
硅烷很容易用于表面改性，但表面需要事先处理，如氧化，以产生可促进硅氧烷键的【富电子】含氧功能团。
这些硅烷的高水媒降解性限制了这些表面与含水缓冲剂和试剂的接触时间。然而，已经开发出各种方法，通过减少硅烷的水介性降解来改善表面润湿性。稳定硅烷介导的功能的最常见方法是在硅烷功能化期间或之后对表面进行高温烘烤。
等离子体增强化学气相沉积（PECVD）是一种主要的技术，它将用户定义的所需功能的厚度移植到表面。这种技术可以在任何类型的表面上沉积一层均匀的官能团，不管该表面是金属还是聚合物。
鉴于用PECVD进行表面修饰的精确性，这种方法被广泛用于制备具有不同润湿性的表面，用于抗体和蛋白质的固定化和免疫测定的开发。PECVD比其他传统的旋涂或滴涂方法更好，因为嫁接功能的高度均匀性和稳定性。
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